●顧 喬（江蘇省鹽城市濱海中學(xué) 江蘇 鹽城 224000）

白首烏（Cynanchum bungeiDecne）是蘿藦科鵝絨藤屬多年生纏繞性草本植物，鹽城濱海特有的中藥材，膨大塊根為主要藥用部位[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，白首烏具有提高機(jī)體免疫力、抗衰老、促進(jìn)毛發(fā)生長、抗腫瘤、保護(hù)腦細(xì)胞、改善大腦記憶力和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、保肝、強(qiáng)心、降脂以及對單胺氧化酶活性的抑制等作用[2-6]。白首烏的人工栽培主要靠塊根的營養(yǎng)繁殖和種子育苗，易受病毒侵害，產(chǎn)量和品質(zhì)受影響，阻礙了規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。將組織培養(yǎng)技術(shù)運(yùn)用到白烏首育種中，可促進(jìn)其研究發(fā)展。

但目前關(guān)于白首烏組織培養(yǎng)方面的報(bào)道較少[7-9]。本研究以濱海白首烏帶腋芽的莖段為試材，探究了最佳滅菌處理和植物生長調(diào)節(jié)劑濃度與種類組合，并誘導(dǎo)獲得愈傷組織和叢生芽，為濱海白首烏的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為江蘇省鹽城市濱海縣白首烏生產(chǎn)基地栽種的白首烏。在晴好天氣的清晨，取田間的白首烏莖段作為外植體，莖段類型為帶腋芽莖段。

1.2 方法

1.2.1 外植體的預(yù)處理剪去外植體的葉片，用軟毛刷清洗莖段表面污垢，置于洗衣粉液中浸泡30min 后再用自來水沖洗2h，備用。

1.2.2 外植體的消毒與接種將外植體移入到超凈工作臺(tái)中，以滅菌后的刀片和鑷子去除帶腋芽的莖段芽鞘，剪成長5cm 左右的單芽莖段，置于無菌廣口瓶中，以無菌水浸泡和清洗。可采用三種滅菌方法，分別為：75%酒精浸泡30s，無菌水清洗5 次，0.1%升汞浸泡10min，無菌水清洗5 次；75%酒精浸泡30s，無菌水清洗5 次，1.0%次氯酸鈉浸泡10min，無菌水清洗5 次；5%酒精消毒30s，無菌水清洗5 次，0.1%吐溫消毒10min，無菌水清洗5 次。滅菌后用無菌濾紙吸干水分，頂端向上并保持節(jié)位腋芽點(diǎn)處于MS 固體培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g/L，瓊脂6.0 g/L，pH=6.0）表面。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選基本培養(yǎng)基為MS 固體培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g/L，瓊脂6.6 g/L，pH=6.0），分別添加不同濃度組合的6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）和IBA（吲哚丁酸），其中6-BA濃度分別為0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L，IBA濃度分別為0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L。以上每個(gè)處理接種3 瓶，每瓶接種8 個(gè)外植體。將外植體置于光照培養(yǎng)箱中，溫度25±1℃，光照強(qiáng)度2 500lx，光照時(shí)間12h/d。定期觀察：外植體接種30 d 后愈傷組織的質(zhì)地、顏色和生長勢，并計(jì)算愈傷組織的出愈率。計(jì)算方式為：

出愈率=（形成愈傷組織的外植體塊數(shù)/接種外植體總塊數(shù)）×100%。

1.2.4 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選將愈傷組織接入含不同激素濃度組合的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，其中NAA（萘乙酸）濃度分別為0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L，TDZ（噻苯?。舛确謩e為0.1 mg/L、0.15 mg/L、0.3 mg/L。以上每個(gè)處理接種3 瓶，每瓶接種8 塊愈傷組織，稱取愈傷組織的鮮重。外植體置于光照培養(yǎng)箱中，溫度25±1℃，光照強(qiáng)度2 500lx，光照時(shí)間16h/d。定期觀察：愈傷組織接種30d 后的形態(tài)變化并稱量鮮重，計(jì)算增殖率與分化率。計(jì)算方式為：

增殖率（%）=（剛接入的愈傷組織鮮重/增殖后的鮮重）×l00%；

分化率（%）=（出芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)）×l00%。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用軟件Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒滅菌方法的篩選

白首烏外植體用不同的滅菌方法處理結(jié)果，見表1。可知，75%酒精+0.1%升汞滅菌效果最好，污染率為0，成活率90%；75%酒精+1.0%次氯酸鈉滅菌效果最差，污染率100%；75%酒精+0.1%吐溫滅菌效果較好，污染率為10%，但死亡個(gè)數(shù)多，可能是因?yàn)橥聹氐亩拘詫ν庵搀w造成了較大的傷害。

表1 不同滅菌處理對白首烏外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響（培養(yǎng)30d）

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合的篩選

帶腋芽白首烏莖段在含不同濃度6-BA 和IBA 組合的MS 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，4d后發(fā)現(xiàn)部分處理的莖段與培養(yǎng)基相接處開始產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，30d 后發(fā)現(xiàn)部分外植體的愈傷組織呈現(xiàn)逐漸膨大的現(xiàn)象，但未發(fā)現(xiàn)叢生芽組織的出現(xiàn)（圖1）。

圖1 帶腋芽白首烏莖段的愈傷組織

由表2 可知，白首烏莖段在6-BA（2.0 mg/L）+IBA（0.2 mg/L）激素組合中出愈率最高，生長量最大，且愈傷組織未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

表2 不同6-BA、IBA 濃度組合對愈傷組織的誘導(dǎo)

2.3 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合的篩選

將生長周期為30d 的愈傷組織轉(zhuǎn)入?yún)采空T導(dǎo)培養(yǎng)基MS+NAA+TDZ，連續(xù)培養(yǎng)30d 后發(fā)現(xiàn)愈傷組織生長均勻，生長量有所增加，且有部分愈傷組織中分化出綠色嫩芽（圖2），即叢生芽的形成。

圖2 叢生芽的誘導(dǎo)

由表3 可知，NAA（0.04 mg/L）+TDZ（0.3 mg/L）為最適組合，該濃度組合的增殖率與分化率最佳。

表3 不同NAA、TDZ 濃度組合對叢生芽的誘導(dǎo)

3 討論

鑒于目前傳統(tǒng)育種方法已很難滿足供需之間差額的現(xiàn)狀，利用組織培養(yǎng)手段快速繁殖藥用植物對于滿足市場需求和保護(hù)野生種植資源具有重大意義，已有較多研究者開展了針對藥用植物的組織培養(yǎng)研究[10-15]。

本研究以濱海白首烏帶腋芽莖段為組織培養(yǎng)的試材，即白首烏的莖節(jié)處產(chǎn)生腋芽，通過切割、轉(zhuǎn)接從而達(dá)到增殖的目的[8]。多個(gè)研究亦證明該結(jié)果，以白首烏帶腋芽莖段為試材可有效提高組織培養(yǎng)的整株獲得率[7,8,16,17]。

本研究發(fā)現(xiàn)6-BA（2.0 mg/L）+IBA（0.2 mg/L）激素組合對于濱海白首烏愈傷組織的誘導(dǎo)效果最佳，與前人研究結(jié)論略有出入。徐飛等[17]發(fā)現(xiàn)1.5 mg/L 6-BA 有利于泰山白首烏愈傷組織的誘導(dǎo)，而KT 和NAA 組合的誘導(dǎo)率最高；余桂紅等[7]發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L 2,4-D 有利于泰安白首烏愈傷組織的誘導(dǎo)。推測這一差異可能是由于白首烏的來源地不同導(dǎo)致。

本研究發(fā)現(xiàn)NAA（0.04 mg/L）+TDZ（0.3 mg/L）激素組合對于濱海白首烏叢生芽的誘導(dǎo)效果最佳，NAA 作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大的作用，多被用于植物組織培養(yǎng)中不定芽和不定根的誘導(dǎo)劑，前人研究結(jié)果亦可證明，通過施加NAA 有利于白首烏叢生芽的誘導(dǎo)效應(yīng)。徐飛等[17]證明0.05 mg/L 的NAA 最有利于白首烏腋芽增殖；余桂紅等[7]發(fā)現(xiàn)MS+ZT（2.0 mg/L）+NAA（0.01 mg/L）對莖段的增殖作用最好。