陳健 孫旭春 趙慶芳

摘要：對(duì)從甘肅省渭源縣采集到的黃芪根腐病病株進(jìn)行了病原菌的分離、純化和致病性檢測(cè)，并對(duì)致病菌形態(tài)學(xué)進(jìn)行了觀察，結(jié)合核糖體DNA（rDNA） ITS序列分析的分子生物學(xué)鑒定，以明確引起黃芪根腐病的致病病原菌。結(jié)果表明：黃芪根腐病致病菌為半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）瘤座孢目（Tuberculariales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的4個(gè)種。共分離出16個(gè)菌株，經(jīng)檢測(cè)有5個(gè)菌株具有致病性，均屬鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporun）1株（9號(hào)菌株），腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）2種（12號(hào)菌株和16號(hào)菌株，其中16號(hào)菌株可能為腐皮鐮刀菌的變種），銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）1株（15號(hào)菌株），待定鐮刀菌1株（14號(hào)菌株，與三線鐮刀菌的同源性僅為88%）。

關(guān)鍵詞：黃芪;根腐病;致病菌鑒定;ITS序列分析;渭源縣

中圖分類號(hào)：S512.1? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2020）10-0021-07

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2020.10.005

Abstract：The root rot strains of Astragalus membranaceus root rot symptom collected from Weiyuan County， Gansu Province were isolated， purified and tested for pathogenicity， and by morphological identification and identification of pathogenic bacteria with molecular identification of ribosomal DNA（rDNA） ITS sequence analysis， so as to identify pathogenic bacteria of causing Astragalus membranaceus root rot. The results show that the pathogen of root rot of astragalus membranaceus was four species of Deuteromycotina， Hyphomycetes， Tubercuariles， Tuberculariaceae， Fusarium， a total of 16 strains were isolated， and 5 strains were detected to be pathogenic， all of which were fusarium， of which 1 strain（strain 9） was Fusarium oxysporum， 2 strains of （strains 12 and strains 16 of which may be a variant of Fusarium solani） were Fusarium solani， 1 strain（strain 15） was Fusarium acuminatum， 1 strain（strain 14， only 88% homologous to Fusarium trichomonas） was determined Fusarium.

Key words：Astragalus membranaceus;Root rot;Pathogenic bacteria identification;ITS sequences analysis;Weiyuan County

黃芪（Astragalus membranaceus）為豆科多年生草本植物，以根入藥，是藥用價(jià)值很高的中藥材[1 - 3 ]。近年來(lái)隨著市場(chǎng)需求量的持續(xù)增加，黃芪種植面積不斷擴(kuò)大，使得輪作周期縮短，重茬和迎茬面積增加，導(dǎo)致黃芪根腐病危害逐年加重，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和質(zhì)量。

黃芪根腐病屬于土傳病害，是土壤中的病原菌和病原線蟲共同作用的結(jié)果，鐮刀菌是引起黃芪根腐病的主要致病菌[4 - 6 ]，目前對(duì)黃芪根腐病致病菌的分類鑒定主要集中在形態(tài)方面，而利用ITS序列分析對(duì)引起黃芪根腐病的致病菌進(jìn)行分子生物學(xué)方面的鑒定目前還尚未見報(bào)道。核糖體DNA（rDNA）-ITS序列在真菌的種間存在著豐富的變異，而在種內(nèi)不同菌株間卻高度保守，所以ITS序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對(duì)差異。此外ITS序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[7 ]。我們對(duì)從甘肅省定西市渭源縣黃芪大田采集到的黃芪根腐病病株進(jìn)行病原菌的分離、純化和致病性檢測(cè)，以確定引起黃芪根腐病的致病菌，并通過形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)合核糖體DNA（rDNA）-ITS序列分析的分子生物學(xué)鑒定，以明確引起黃芪根腐病的致病病原菌的分類地位。

1? ?材料與方法

1.1? ?病樣采集

從甘肅省定西市渭源縣會(huì)川鎮(zhèn)黃芪種植地采集黃芪根腐病帶病植株。采集地為平川地，選取5塊種植地，每塊地采集3個(gè)病株。選根腐病發(fā)生比較嚴(yán)重的黃芪植株為供試樣本。

1.2? ?病原菌分離純化

采用組織分離法分離黃芪根腐病病原 菌[8 ]。將初步分離所得菌株配制成孢子懸浮液（孢子濃度為10×40倍鏡下每視野約為5～10個(gè)孢子），取1 mL混勻至PDA培養(yǎng)基中在25 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單個(gè)菌落時(shí)觀察每個(gè)菌落形態(tài)并在顯微鏡下觀察菌絲的結(jié)構(gòu)。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上每個(gè)菌落的特征一致則確定該菌株為純種，并轉(zhuǎn)接試管斜面4 ℃保存;如果觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上菌落的特征不一致，需再次純化，直至培養(yǎng)基上菌落特征一致。

1.3? ?病原菌致病性檢測(cè)

黃芪種子經(jīng)催芽消毒后種植于盆內(nèi)，待子葉完全舒展、長(zhǎng)出4～6片真葉時(shí)采用根部切傷接種法[8 ]。將病原菌孢子懸浮液（孢子濃度10×40倍鏡下每視野約為50～60個(gè)孢子） 2 mL滴加到植株附近土壤中，每盆選取兩處空隙共加入4 mL孢子懸浮液，黑暗培養(yǎng)24 h，然后正常光照培養(yǎng)。每個(gè)菌株接種3盆，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，觀察對(duì)黃芪幼苗的致病情況。以幼苗根部腐爛、地上部分枯死為標(biāo)準(zhǔn)判定該幼苗發(fā)病，計(jì)算幼苗發(fā)病率（%）和病情指數(shù)（DI）。

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=[∑（V·f）/（m·N）]×100%

其中，V為該嚴(yán)重度的級(jí)值，f為該級(jí)病株數(shù)，m為最高級(jí)值，N為調(diào)查發(fā)病總株數(shù)。根腐病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，沒有病害癥狀;1級(jí)，1%～25%植株受到損害;2級(jí)，26%～50%植株受到損害;3級(jí)，51%～75%植株受到損害;4級(jí)，76%～100%植株受到損害。

1.4? ?致病菌的形態(tài)鑒定

根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》所描述的無(wú)性器官形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀對(duì)致病菌菌落、菌絲體、孢子體等進(jìn)行形態(tài)鑒定，鑒定到種[9 ]。

1.5? ?致病菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.1? ? 致病菌總DNA的提取? ? 將活化的致病菌接入100 mL真菌液體培養(yǎng)基I中，恒溫培養(yǎng)5～7 d，真空抽濾得到干燥菌絲體。采用改良的真菌DNA提取方法提取黃芪根腐病致病菌總DNA[10 ]。以DS2000為DNA Marker，在含0.5 μg/mL EB的1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳60 min（120 V），電泳緩沖液為0.5×TBE溶液，檢測(cè)DNA質(zhì)量。在凝膠圖像分析系統(tǒng)中照相。

1.5.2? ? 致病菌核糖體DNA（rDNA）- ITS片段的PCR擴(kuò)增? ?采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS通用引物ITSl和ITS4[11 ]，對(duì)提取DNA中ITS和5.8S rDNA（ITS包括18S rDNA和5.8S rDNA之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITSl與5.8S rDNA和28S rDNA之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25μL：水13.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，Mg2+（25 mM）1.5 μL，dNTP（各2 mM）2 μL，Taq（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物 （20 μM） 各1.5 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)熱5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后于72 ℃延伸10 mins，溫度降至10 ℃反應(yīng)完畢。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL反應(yīng)物在含0.5 μg/mL EB的1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳60 min（120 v），以DS 2000為DNA Marker，電泳緩沖液為0.5×TBE溶液，檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。在凝膠圖像分析系統(tǒng)中照相。

1.5.3? ? PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化? ? 采用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.5.4? ? ?ITS片段的測(cè)序及序列分析? ? 將經(jīng)過純化的PCR產(chǎn)物送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，做雙向測(cè)序。將所測(cè)ITS序列用Seqman軟件（DNAsrar）拼接。采用Clustal X 1.83軟件將拼接后的ITS序列與GenBank中檢索已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS序列片段多序列比對(duì)，進(jìn)行同源性比較，使用MEGA（Version 4.0）軟件分析，采用最小進(jìn)化法 （Minimum Evolution theord，ME）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步確定致病菌的類別和分類地位。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?分離結(jié)果

從黃芪根腐病患病植株中得到36株分離物，通過觀察菌落特征、菌落形態(tài)、菌絲顏色、菌絲分泌的色素在PDA培養(yǎng)基上形成的顏色及顯微鏡下孢子體結(jié)構(gòu)和大小，確定有16種分離物，初步確定為半知菌綱叢梗孢目瘤座孢科鐮刀菌屬真菌。

2.2? ?致病性檢測(cè)

致病性檢測(cè)結(jié)果（表1）表明，9號(hào)菌株、12號(hào)菌株、14號(hào)菌株、15號(hào)菌株、16號(hào)菌株均具有致病性（發(fā)病率超過25%，病情指數(shù)在16以上），黃芪幼苗的發(fā)病率分別為32.45%、30.65%、29.55%、40.15%、28.57%，病情指數(shù)均在16以上。其中15號(hào)菌株發(fā)病率最高，為40.15%，病情指數(shù)為20.31。發(fā)病黃芪癥狀與田間植株自然發(fā)病癥狀一致，從發(fā)病黃芪幼苗和土壤中進(jìn)行病原菌地再分離，均能得到引起黃芪幼苗發(fā)病的病原菌，確定該5個(gè)菌株為黃芪根腐病致病菌。

2.3? ?形態(tài)鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，9號(hào)菌株菌落白色絮狀，菌絲較長(zhǎng)，致密，中間或邊緣有明顯的隆起，菌落背面米白色。分生孢子梗無(wú)色，頂生卵形、鐮刀形分生孢子。大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，稍彎曲，兩端漸窄，具鉤狀，具1～5隔膜，多為3隔膜;厚垣孢子頂生，橢圓形或球形，平滑。初步確定為尖孢鐮刀菌（Fusarium. oxysporum）。12號(hào)菌株菌落土灰色至淡粉色，由內(nèi)向外出現(xiàn)環(huán)狀顏色變化，中間有微黃色的斑點(diǎn)，無(wú)隆起，生長(zhǎng)較均勻，菌落背面淡黃色和乳黃色;分生孢子梗單瓶梗狀，伸長(zhǎng)不分枝;大型分生孢子紡錘形、香腸型，短而胖，稍彎曲，兩端較鈍，有3～5個(gè)隔膜，多數(shù)為3隔;小型分生孢子橢圓形、腎形，單細(xì)胞無(wú)色;厚垣孢子間生，球形，表面光滑。初步確定為腐皮鐮刀菌（Fusarium. solani）。14號(hào)菌株菌落乳白色、白色，菌絲較短，短絨狀，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，中間有明顯的隆起;菌落背面為淺黃色。分生孢子梗螺旋式伸長(zhǎng)、不分枝。大型分生孢子兩端尖削或頂端尖，紡錘形至鐮刀形彎曲或端直，具2～5隔，多數(shù)為3隔。小型分生孢子數(shù)量少，梭形至腎臟形，單胞，無(wú)隔膜，厚垣孢子橢圓形，表面光滑，間生于菌絲中間。由于無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)特征，從形態(tài)學(xué)只能初步確定為鐮刀菌屬中的1種。15號(hào)菌株菌落白色至淡黃色，菌絲較厚，致密，絨狀;菌落背面為橘黃色，有明顯的菌圈;分生孢子梗螺旋狀，單瓶梗;小型分生孢子數(shù)量少，呈梭形、長(zhǎng)橢圓形、腎形或卵形，單細(xì)胞，有1～2個(gè)隔;大型分生孢子細(xì)鐮刀形，彎曲度大，向兩端漸趨尖削，具3～5隔，多數(shù)為3隔;厚垣孢子串生與菌絲中間。初步確定為銳頂鐮刀菌。16號(hào)菌株分生孢子梗伸長(zhǎng)，單瓶梗狀，較長(zhǎng);大型分生孢子數(shù)量多，紡錘形或鐮刀形，稍彎曲，兩端較鈍圓，有3～5個(gè)隔，多數(shù)為3隔;小型分生孢子數(shù)量多，長(zhǎng)橢圓形、卵形，單細(xì)胞，無(wú)分隔;厚垣孢間生，單生，橢圓形或圓形，表面光滑;菌落白色，菌絲較稀薄，平鋪，菌絲較長(zhǎng)，生長(zhǎng)較均勻;菌落背面中間為淡黃色，邊緣為乳白色。其形態(tài)特征跟12號(hào)菌株相似，菌落形狀和顏色有差別，較難判定，可能為腐皮鐮刀菌（Fusarium. solani）的變種。

2.4? ?ITS序列分析

2.4.1? ? 致病菌DNA提取及檢測(cè)結(jié)果? ? 如圖1所示，5種致病菌的DNA提取結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后未出現(xiàn)拖尾等現(xiàn)象，濃度跟標(biāo)準(zhǔn)Maker濃度相比無(wú)顯著差異。DNA質(zhì)量和濃度均可滿足下一步試驗(yàn)。

2.4.2? ? 致病菌ITS片段的擴(kuò)增? ? 采用真菌核糖體ITS區(qū)通用引物ITS1和ITS4對(duì)5種致病菌的ITS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，5個(gè)菌株擴(kuò)增后均產(chǎn)生穩(wěn)定的條帶，條帶均在500～750 bp。

2.4.3? ? ITS序列分析? ? 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，將純化產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行ITS序列雙向測(cè)序，雙向測(cè)序結(jié)果經(jīng)SeqMan軟件拼接并輸出全序列，9號(hào)菌株、12號(hào)菌株、14號(hào)菌株、15號(hào)菌株和16號(hào)菌株的rDNA-ITS序列長(zhǎng)度分別為486 bp、 502 bp、510 bp、516 bp、536 bp。經(jīng)DNAMAN軟件多序列分析，對(duì)5個(gè)菌株核糖體DNA ITS片段序列的拼接結(jié)果在Genbank 中進(jìn)行同源性比較，其中與9號(hào)菌株同源性最高的ITS序列菌株全部為尖孢鐮刀菌，其同源性均為100%，可以確定9號(hào)菌株為尖孢鐮刀菌;15號(hào)菌株核糖體DNA- ITS序列與Genbank中銳頂鐮刀菌的同源性均為99%，僅有1個(gè)堿基的差異，可以確定15號(hào)菌株為銳頂鐮刀菌;12號(hào)菌株和16號(hào)菌株與其同源性最高的ITS序列菌株全部為腐皮鐮刀菌（茄腐鐮刀菌），與它們的同源性為99%，僅有1個(gè)堿基的差異，后經(jīng)DNAMAN軟件比對(duì)，發(fā)現(xiàn)12號(hào)菌株和16號(hào)菌株的同源性為85.89%。確定12號(hào)菌株和16號(hào)菌株同為腐皮鐮刀菌（茄腐鐮刀菌），由于其形態(tài)特征有差異，初步認(rèn)為16號(hào)菌株可能是腐皮鐮刀菌的一個(gè)變種。與14號(hào)菌株同源性高的ITS序列菌株均為三線鐮刀菌，但其同源性最高為88%，無(wú)法確定到種。

使用多序列比對(duì)分析軟件Clustal X軟件（Version 1.83）將5個(gè)菌株的rDNA-ITS序列與從Genbank中下載的尖孢鐮刀菌、腐皮鐮孢菌、銳頂鐮孢菌、三線鐮刀菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行序列的聯(lián)配比較（Alignment），序列最后以Clustal格式輸出。選擇絲孢綱瘤座孢目瘤座孢科擬黑粉菌屬（Ustilaginoidea）作為外類群，使用MEGA（Version 4.0）軟件進(jìn)行分析，采用最小進(jìn)化法（Minimum Evolution theord，ME）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用自展（Bootstrap）分析法進(jìn)行檢驗(yàn)，共循環(huán)1 000次 （圖3） 。

由圖3可以看出，9號(hào)菌株與5株尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的親緣關(guān)系最近，聚為一小分支，其Bootstrap的支持率為99%;12號(hào)菌株與10株腐皮鐮孢菌（茄腐鐮孢菌）（F. solani）親緣關(guān)系最近，Bootstrap的支持率為99%。此外，ITS系統(tǒng)發(fā)育樹表明，16號(hào)菌株與12號(hào)菌株的關(guān)系較近，它們聚為一組，處于同一個(gè)分支下，其Bootstrap的支持率為99%;15號(hào)菌株與5株銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）的ITS序列無(wú)明顯差異，聚為一小分支，Bootstrap的支持率為99%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它與三線鐮刀菌（F. tricinctum）的親緣關(guān)系也比較近，處于同一分支下，其Bootstrap的支持率也為99%。14號(hào)菌株同源性高的ITS序列菌株均為三線鐮刀菌，但其同源性最高僅為88%，在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，14號(hào)菌株與處于銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）和三線鐮刀菌（F. tricinctum）的分支親緣關(guān)系最近，聚為一小分支，Bootstrap的支持率僅為54%。由可以認(rèn)為，9號(hào)菌株為尖孢鐮刀菌，12號(hào)菌株和16號(hào)菌株為腐皮鐮刀菌，15號(hào)菌株為銳頂鐮刀菌，14號(hào)菌株與銳頂鐮刀菌和三線鐮刀菌的親緣關(guān)系都比較近，具體屬于哪一類鐮刀菌，需做進(jìn)一步鑒定。

3? ?結(jié)論與討論

很多病原菌能夠引起植物根腐病，已報(bào)道的有鐮刀菌、絲核菌、腐霉等。在鐮刀菌屬（Fusarium）真菌中，有許多是危害經(jīng)濟(jì)作物的重要病原菌，它們是植物維管束系統(tǒng)的寄生菌，在適宜的環(huán)境條件下，不但破壞作物的輸導(dǎo)組織維管束，還在菌體生長(zhǎng)發(fā)育代謝過程中產(chǎn)生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影響產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致產(chǎn)量顯著下降[12 ]。梁巧蘭等[13 ]報(bào)道，尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌是引起觀賞百合根腐病的主要致病菌。李敏權(quán)等[14 ]對(duì)甘肅中部干旱地區(qū)苜蓿根腐病進(jìn)行了分離鑒定，確認(rèn)在該地區(qū)苜蓿根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌、銳頂鐮刀菌和半裸鐮刀菌。本試驗(yàn)研究通過采集帶病的黃芪根腐病植株，依據(jù)組織分離法對(duì)黃芪根腐病的病原菌進(jìn)行了分離、純化，分離得到的病原菌通過回接的致病性檢測(cè)，14 d后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，癥狀與田間癥狀相同，而對(duì)照組不發(fā)病。根據(jù)致病菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀的觀察結(jié)果，再結(jié)合核糖體DNA（rDNA）ITS序列測(cè)定的結(jié)果，將致病菌鑒定為半知菌亞門（Deuteromycotina）絲孢綱（Hyphomycetes）瘤座孢目（Tuberculariales）瘤座孢科（Tuberculariaceae）鐮刀菌屬（Fusarium）的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、 腐皮鐮孢菌（F. solani）和銳頂鐮孢菌（F. acuminatum）。其中銳頂鐮孢菌的致病力最強(qiáng)，接種后發(fā)病率最高為40.15%;尖鐮孢菌的致病力較弱，接種后發(fā)病率為32.45%;腐皮鐮孢菌的致病力最弱，接種后發(fā)病率為28.57%～30.65%。鄧成貴[4 ]、王立新等[15 ]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪根腐病病原菌經(jīng)分離、致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)鑒定初步確定為腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌，本研究從分子生物學(xué)水平進(jìn)一步鑒定出引起黃芪根腐病的致病菌為腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和銳頂鐮刀菌。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證分離出的致病菌，我們對(duì)形態(tài)上已初步確定的5種致病菌的核糖體DNA-ITS序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)9號(hào)菌株的致病菌尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和12號(hào)菌株、16號(hào)菌株的腐皮鐮刀菌（F. solani）與GenBank中的F. oxysporum和F. solani、F. acuminatum同源性都很高，同源性分別為100%和99%，系統(tǒng)發(fā)育樹上Bootstrap的支持率為99%。由于形態(tài)學(xué)上有差異，16號(hào)菌株的致病菌可能為腐皮鐮刀菌的變種，需做進(jìn)一步鑒定。15號(hào)菌株的致病菌與GenBank中F. acuminatum的同源性也在99%以上，在系統(tǒng)發(fā)育樹與銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）的親緣關(guān)系也比較近，其Bootstrap的支持率也為99%，可確定15號(hào)菌株為銳頂鐮刀菌。Renske Landeweert等[16 ]認(rèn)為，通過ITS區(qū)域比對(duì)，序列相似性大于99%，可鑒別為相同種;序列相似性大于95%且小于99%，可鑒別為相同屬;序列相似性小于95%，可鑒別為相同科。14號(hào)菌株的致病菌其序列與標(biāo)準(zhǔn)菌株三線鐮刀菌ITS序列的最高同源性僅為88%。在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，14號(hào)菌株與處于銳頂鐮刀菌（F. acuminatum）和三線鐮刀菌（F. tricinctum）的分支親緣關(guān)系最近，聚為一小分支，Bootstrap的支持率僅為54%。由于其同源性小于95%，故14號(hào)菌株具體為鐮刀菌屬哪一種，有待于進(jìn)一步研究。

雖然傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與分子鑒定和種間系統(tǒng)發(fā)育分析之間常常存在著不一致的情況[17 ]，但在本研究中，尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和銳頂鐮刀菌ITS序列的同源性比較結(jié)果表明同源性對(duì)比的結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果是一致的，證明ITS序列對(duì)于真菌鐮刀菌屬種間鑒定是可行的，可以作為快速檢測(cè)、鑒定鐮刀菌的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張東佳，楊永建，趙汝能.? 甘肅黃芪屬藥用植物資源[J] .? 中國(guó)野生植物資源，2005，24（1）：38-40.

[2] 管青霞，李城德，李錦龍，等.? 蒙古黃芪覆膜露頭栽培技術(shù)規(guī)程[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2019（5）：84-87.

[3] 尚虎山，楊榮洲，權(quán)小兵，等.? 產(chǎn)地土壤養(yǎng)分與黃芪產(chǎn)量和質(zhì)量的相關(guān)性分析[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2018（9）：49-51.

[4] 鄧成貴.? 黃芪根腐病病原鑒定研究初報(bào)[J].? 中藥材，2005（2）：85.

[5] 丁文姣，于安芬，李瑞琴，等.? 根腐病病原菌粗提物脅迫下黃芪幼根代謝變化初探[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2018（12）：31-34.

[6] 丁文姣，于安芬，李瑞琴，等.? 定西市黃芪根腐病優(yōu)勢(shì)病原菌生物學(xué)特性研究[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2018（3）：33-36.

[7] LEBLOND-BOURGETN，HERVEP，IRENEM，et al.? 16S rRNA and 16S to 23S internal transcribed spacer sequence analyses reveal inter and intraspecific bifidobacterium phylogeny[J].? Int. J. Syst. Bacteriol.，1996，46：102-111.

[8] 馬晶晶.? 板藍(lán)根根腐病病原菌鑒定及抑菌中草藥提取物的篩選[D].? 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué).

[9] 魏景超.? 真菌鑒定手冊(cè)[M].? 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[10] 李紹蘭，周 斌，楊麗源，等.? 真菌DNA提取方法的改良[J].? 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002， 24（6）：471-472.

[11] WANG Y C，ZHANG Z G，ZHENG X B.? Use ITS regions of rRNA gens as an additional charaeteristic inidentifieation of Phytophthora boehmeriae and P.cactotum[J].? Mycosystema，2000，19：485-91.

[12] 林清洪，黃志宏.? 鐮刀菌研究概述[J].? 亞熱帶植物通訊，1996，25（1）：51-56.

[13] 梁巧蘭，徐秉良，劉艷梅.? 觀賞百合根腐病病原菌鑒定及藥劑篩選[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39（1）：25-28.

[14] 李敏權(quán)，柴兆祥，李金花，等.? 定西地區(qū)苜蓿根和根頸腐爛病病原研究[J].? 草地學(xué)報(bào)，2003，11（1）：83-86.

[15] 王立新，孫先榮，白全江，等.? 黃芪根腐病病原菌鑒定[J].? 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1994，9（2）：107-109.

[16]RENSKE L，PAULA L，THOMW K，et a1. Appplied and environmental[J].? Microbiology，2003，69（1）：327-333.

[17] KEITH L M，VELASQUEZ M E，ZEE F T.? Identification and characterization of Pestalotiopsis spp. causing scab disease of guava，Psidium guajava，in Hawaii[J].? Plant Disease，2006，90（1）：16-23.

（本文責(zé)編：鄭立龍）