魏士杰+王穎+陳文強+孔亞男

摘要：以藥用植物虎杖為試驗材料，采用組織勻漿方法對其根腐病病原菌進行分離，并通過浸根接種和針刺菌液2種侵染方法做植物人工侵染回歸試驗，篩選出致病菌株P051。經(jīng)接觸酶、氧化酶和糖發(fā)酵等生理生化試驗與形態(tài)學、分子生物學鑒定表明，藥用植物虎杖中1株根腐病的致病菌株P051為微球菌科微球菌屬藤黃微球菌（Micrococcus luteus）。研究結(jié)果為秦巴山區(qū)藥用植物虎杖的栽培、保護和利用提供了依據(jù)。

關鍵詞：虎杖；根腐病；藤黃微球菌；分離；鑒定

中圖分類號： S435.672 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0141-04

虎杖（Polygonum cuspidatum）別稱假川七、土川七、紅三七、三七或日本蓼，為蓼科蓼屬的多年生草本植物[1]，廣泛分布于山東、河南、陜西、湖北、湖南等地[2]?；⒄雀案鶢钋o切片可入藥，具有祛風利濕、活血化瘀、止咳化痰、消腫止痛等功效[3-4]?；⒄忍崛∥锖邪邹继J醇、大黃素、蒽醌類等有效成分[5-6]，對心臟病[7]、高血脂[8]、癌癥[9]等具有很好的療效，已成為國內(nèi)外學者研究的熱點。

根腐病是藥用植物生長過程中一種常見的頑固性病害。在中藥材生產(chǎn)過程中，根腐病會造成藥材不同程度地減產(chǎn)，嚴重影響中藥材的生產(chǎn)和品質(zhì)[10]。近年來，有關虎杖的研究多集中在藥理及活性成分[11-12]，對種植和栽培過程中的病害研究鮮有報道。梁萍等對虎杖銹病進行了研究，采用形態(tài)學方法鑒定其為兩棲蓼柄銹菌（Puccinia polygoni）[13]。目前，對虎杖根腐病病原菌的研究尚無報道。因此，本研究對1株藥用植物虎杖根腐病病原菌進行分離和鑒定，以期為秦巴山區(qū)珍稀藥用植物虎杖的栽培、保護和利用奠定基礎。

[BT1-*8]1 材料與方法

1.1 試驗材料

藥用植物虎杖病株采自陜西省漢中市留壩縣馬道鎮(zhèn)，為野生植株。供試1年生虎杖幼苗購自萬源市邱佳坪虎杖種植基地。

1.1.1 材料與試劑 營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0 g、pH值7.4；液體LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、NaCl 10.0 g、pH值7.4；糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5.0 g、牛肉膏蛋白胨10.0 g、Na2HPO4·12H2O 2.0 g、NaCl 3.0 g、指示劑溴甲酚紫1 mL、pH值7.4；乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖5.0 g、蛋白胨2.0 g、NaCl 3.0 g、Na2HPO4·12H2O 2.0 g、指示劑溴甲酚紫1.0 mL、pH值7.4；甘露糖發(fā)酵培養(yǎng)基：甘露醇5.0 g、蛋白胨2.0 g、NaCl 3.0 g、Na2HPO4·12H2O 2.0 g、指示劑溴甲酚紫1.0 mL、pH值7.4；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基：甘露醇5.0 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 5.0 g、KH2PO4 0.5 g、指示劑溴甲酚紫1.0 mL、pH值7.4；營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、明膠120.0 g、pH值7.4；硝酸鹽培養(yǎng)基：KNO3 1.0 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蔗糖20.0 g、pH值7.2；七葉苷培養(yǎng)基：胰蛋白胨 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、七葉苷3.0 g、檸檬酸鐵銨0.5 g、pH值6.9～7.1。

大腸桿菌（Escherichia cdi，ATCC8739）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、藤黃微球菌，均由陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供。

葡萄糖、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O均為分析純；瓊脂、牛肉膏、瓊脂、蛋白胨、胰蛋白胨、甘露醇、明膠、指示劑溴甲酚紫，由山西津華暉星制藥有限公司提供。格里斯氏（Griess）試劑A：對氨基苯磺酸0.5 g、10%稀乙酸150 mL；格里斯氏（Griess）試劑B：α-萘胺 0.1 g、H2O 20 mL、10%稀乙酸150 mL；二苯胺試劑：二苯胺 0.5 g溶于100 mL濃硫酸中，用20 mL蒸餾水稀釋。

1.1.2 儀器與設備 LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋，上海醫(yī)用核子儀器廠；TB-214電子分析天平，北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LRH-250-GS數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；Q/BKYY31-2000恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；SUPL超純水機，上海申分分析儀器有限公司；SBP100-20可調(diào)式微量移液器，美國Select Bioproducts公司；SW-CJ-1F 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SA3000普通生物顯微鏡，北京泰克儀器有限公司；ZHWY-210 2C恒溫搖床，上海志成有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離與純化 參考王曉麗等對朝鮮薊根莖腐爛病病原菌的分離方法[14]，用無菌手術刀將根表面泥沙及腐爛組織除去，無菌水沖洗，75%乙醇處理5 min，然后用0.1% HgCl2浸泡2 min，取病健交界處組織約1.0 g，在9.0 mL無菌水中搗碎，制成10-1濃度菌液，依次稀釋至10-4濃度。各取10-3、10-4濃度菌液100 μL，涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，30 °C培養(yǎng)18～36 h。挑取不同菌落進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 回歸試驗 采用浸根接種法[15]，挑取純化的病原菌菌落于液體LB培養(yǎng)基發(fā)酵24 h，用血球板計數(shù)，分別取菌液濃度1.0×106、1.0×107、1.0×108 CFU/mL作為接種液，將購自種植基地的正常虎杖1年生苗根部用無菌水洗凈，然后用70%乙醇處理約1 min，去除表面雜菌，再浸入接種液中20 min。各濃度接種液做相同處理。同時將正?；⒄?年生苗根系浸入未接種病原菌的無菌水內(nèi)作為對照。將試驗組及對照組均移栽至備好的花盆內(nèi)，放置于溫度25～30 ℃下，每組5株虎杖根苗，3組重復，觀察發(fā)病情況。

同時，采用針刺菌液法，取正常虎杖1年生根苗，根部用無菌水洗凈，后用70%乙醇處理約1 min，去除表面雜菌，用無菌針蘸取接種液刺傷根部，5～8孔/條為宜，用無菌脫脂棉蘸無菌水覆蓋傷口處保濕，用無菌棉線固定。各濃度均做相同處理。同時用無菌針將根部刺傷，以脫脂棉蘸無菌水覆蓋傷口，用無菌棉線固定，作為對照。放置于溫度28 ℃下，每組5株虎杖根苗，3組重復，觀察發(fā)病情況。

1.2.3 致病菌株的分離 對回歸試驗中表現(xiàn)出與發(fā)病植株相同癥狀的虎杖根苗按“1.2.1”節(jié)的方法重新分離病原菌，因虎杖根苗較幼嫩，故將消毒時間減半。

1.2.4 致病菌的形態(tài)及生理生化反應鑒定 對已確定具有致病性的菌株進行菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色。接觸酶試驗、氧化酶試驗、糖發(fā)酵試驗、明膠液化試驗、七葉苷水解試驗按照《伯杰細菌鑒定手冊》以及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對病原菌進行初步鑒定；硝酸鹽還原試驗參照文獻[16]。

1.2.5 致病菌的分子生物學鑒定 菌株DNA的提取：溶菌酶-SDS法[17]。PCR擴增：以提取的菌株DNA為PCR擴增模板，引物為細菌16S rDNA基因通用引物，27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1 492R：（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。PCR反應條件：94 ℃5 min；95 ℃1 min，57 ℃ 70 s，72 ℃2 min，共32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，將目的條帶清晰的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。將所測序列與基因庫（GenBank）中相對應的數(shù)據(jù)進行相似性比對，挑選相似度>98%的模式菌株序列，用MEGA 5軟件，選擇近鄰結(jié)合法（Neighbor-Joining，NJ），選擇 1 000 個重復作Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與純化

從發(fā)病的虎杖根中分離得到疑似致病菌，并在1年生正?；⒄雀缰杏媒臃N法和針刺菌液法分別對疑似致病菌做回歸試驗，發(fā)現(xiàn)有1株細菌在10 d內(nèi)使正常虎杖根苗發(fā)病，病情與采集到的發(fā)病虎杖植株相似。后從發(fā)病的虎杖根苗中重新分離致病菌，分離到的菌株與原疑似致病菌在菌落形態(tài)上保持一致，將此菌株編號為P051。

2.2 菌株P051的回歸試驗

菌株P051的菌液分別用浸根接種法和針刺菌液法研究其所致虎杖正常根苗的發(fā)病情況。

表1結(jié)果表明，采用浸根接種法時，正?；⒄雀缭诰簼舛冗_到1.0×107 CFU/mL時開始出現(xiàn)病變植株，此濃度的最高發(fā)病率為40%；當菌液濃度達到1.0×108 CFU/mL時，根苗的發(fā)病率明顯提高，達到60%。

表2結(jié)果表明，采用針刺菌液法時，菌液濃度為1.0×106 CFU/mL 時就有根苗針刺部位出現(xiàn)輕微腐爛，且發(fā)病時間較浸根接種法早；當菌液濃度達到1.0×108 CFU/mL時，根苗幾乎全部發(fā)病。由此可知，該菌株為虎杖根部腐爛的致病菌或是其中的1種。

2.3 菌株P051的菌落形態(tài)

菌株P051在NA培養(yǎng)基上能較好地生長，28 ℃下培養(yǎng)36 h，菌株P051的菌落形態(tài)見圖1，顯微形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果見圖2。

圖1、圖2顯示，菌株P051菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，黃色，有突起，不透明；革蘭氏染色陽性，細胞球形，無運動能力，多呈四聯(lián)或簇狀排列，且無芽孢形成。

2.4 菌株P051的生理生化試驗

接觸酶試驗：供試菌中滴加3% H2O2后載玻片上立即出現(xiàn)大量氣泡，說明菌株P051含有過氧化氫酶，能催化過氧化氫產(chǎn)生水和氧氣，即接觸酶試驗呈陽性。

氧化酶試驗：滴加1%鹽酸四甲基對苯二胺溶液，濾紙出現(xiàn)紫色，說明菌株P051含有氧化酶，能與對二苯胺發(fā)生反應，生成有色的醌類化合物，即氧化酶反應呈陽性。

糖發(fā)酵試驗：供試菌分別接種至以葡萄糖、乳糖、甘露糖等為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)24～36 h，以大腸桿菌作為對照。圖3顯示，菌株P051不能利用葡萄糖碳源發(fā)酵。其他糖發(fā)酵試驗均顯示陰性。

明膠液化試驗：挑取供試菌穿刺接種于配置好的營養(yǎng)明膠斜面培養(yǎng)基中，36 ℃下培養(yǎng)，以不接種供試菌的營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基作為對照，圖4顯示，菌株P051含有蛋白水解酶，可將明膠水解而液化，明膠試驗呈陽性。

七葉苷水解試驗：將菌株P051接種于七葉苷試管培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)2～4 d，以類腸球菌為對照。圖5顯示，培養(yǎng)基不變色，說明菌株P051不能將七葉苷分解，七葉苷水解試驗呈陰性。

硝酸鹽還原試驗：將菌株P051接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)5 d，以大腸桿菌為對照。圖6顯示，滴加A液和B液后并未變紅。為驗證是否出現(xiàn)假陰性，另取培養(yǎng)液少許，滴加二苯胺后變?yōu)樗{色，說明菌株P051不能將硝酸鹽還原為亞硝酸，硝酸鹽還原試驗呈陰性。

2.5 菌株P051的生理生化試驗特征

表3表明，菌株P051在接觸酶、氧化酶、葡萄糖、乳糖、甘露醇、明膠液化、硝酸鹽還原、七葉苷水解等方面表現(xiàn)與藤黃微球菌標準均一致。

2.6 菌株P051的分子生物學鑒定

將所測序列與GenBank中相對應的數(shù)據(jù)進行相似性比對，挑選相似度>98%的模式菌株序列，用MEGA 5軟件，采用近鄰結(jié)合法選擇1 000個重復作Bootstrap值分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖7顯示，菌株P051與GenBank中的已知種Micrococcus luteus在同一聚類分支上，親緣關系最相近，且自展支持率為97。結(jié)合菌株P051的菌落形態(tài)、生理生化反應特征以及16S rDNA堿基序列分析結(jié)果，秦巴山區(qū)藥用植物虎杖根腐病原菌株P051可鑒定為微球菌科微球菌屬藤黃微球菌（Micrococcus luteus）。

3 結(jié)論

本研究參考對中藥材掌葉大黃[18]、麻黃[19]、桑樹[20]根部病害的相關報道，對秦巴山區(qū)藥用植物虎杖根部腐爛的致病菌進行分離，通過回歸試驗確定1株致病菌，編號為P051。對此菌株進行形態(tài)學鑒定及接觸酶、氧化酶、葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、甘露醇發(fā)酵、明膠液化、硝酸鹽還原等生理生化試驗和分子生物學鑒定，確定此菌株為微球菌科微球菌屬藤黃微球菌（Micrococcus luteus）。在植物回歸試驗中，分別采取浸根接種法和針刺菌液法2種侵染方法，保證了試驗的可信度。

植物根腐病大多是由多種病原菌共同侵染的結(jié)果[21-26]，本研究分離得到的1株藤黃微球菌可能僅是導致虎杖根部腐爛的病原菌中的1種，是否還有其他微生物導致虎杖根部腐爛，尚須進一步研究。

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