劉勝坤 胡劍民 朱紅軍 尹曉蛟 楊旭

摘?要：?采用ISSR分子標記方法，對13份重樓屬種質資源間的遺傳多樣性進行了分析。結果顯示，12條引物擴增出181條清晰條帶，其中174條多態(tài)性帶，平均多態(tài)性比率為96.13%;Nei's基因多樣性指數(shù)范圍為0.214～0.327，香農指數(shù)范圍為0.351～0.500，樣品間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.293～0.624;通過聚類分析將重樓種質分為3類。結果表明，重樓屬種質具有豐富的遺傳多樣性，ISSR是研究重樓種質資源遺傳多態(tài)性及親緣關系的重要手段之一。

關鍵詞：?重樓;種質資源;ISSR;遺傳多樣性

中圖分類號：Q94???文獻標識碼：A???文章編號：1004-3020（2020）05-0020-04

Abstract：?Genetic diversity in 13 Paris species resources collected was evaluated by ISSR markers.The results showed that 181 bands was amplified by 12 primers，174 of which were polymorphic，with an average polymorphism rate of 96.13%. Nei's diversity indicates ranged from 0.214 to 0.327，Shannon's information index ranged from 0.351 to 0.500 and the genetic similarity coefficients among the tested cultivates ranged from 0.293 to 0.624.Paris germplasms was divided into 3 types by cluster analysis AFLP markers were suitable to analyze genetic diversities and genetic relationships of Camellia japonica Germplasms.The results showed that there was abundant genetic diversity in the Paris germplasms and ISSR was one of the important methods to study genetic polymorphism and genetic relationship of the Paris species resources.

Key words：?Paris;species resources;ISSR;genetic diversity

重樓隸屬于百合科重樓屬Paris L.，為多年生草本植物，又名蚤休、七葉一枝花、草河車、海螺七等[1]。中國共有24種重樓、12個變種、兩個變型，主要分布在中國的云南、貴州、廣東、廣西、四川、湖北等地[2]。重樓的化學成分主要為甾體皂苷、孕甾烷苷、脂肪酸酯、甾醇及其苷、黃酮苷、β-蛻皮激素、多糖等，具有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚的功效，常用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風抽搐[3]。近年來，由于重樓藥用價值高，市場需求量大，重樓價格也隨之上漲，直接導致了野生重樓屬資源急劇減少，個別物種甚至瀕臨滅絕。因此，如何合理利用野生重樓資源，保護重樓資源的生物多樣性是當前面臨的主要問題。

以往對重樓屬植物遺傳多樣性的研究多以形態(tài)學比較研究為主，而同一遺傳型易受環(huán)境的影響而出現(xiàn)不同的表型（環(huán)境飾變），存在很大的局限性和不確定性，對性狀相似的種類很難鑒別。在此背景下，新的遺傳多態(tài)性檢測手段——DNA分子標記技術應運而生，目前已有部分學者利用AFLP[5]、SSR[6]、RAPD[7]、CDDP[8]、SCOT[9]等對重樓開展了相關研究，而利用簡單重復序列中間區(qū)域技術（ISSR，Inter-simple sequence repeats）對重樓屬種質資源遺傳多樣性進行研究的報道甚少。與其它分子標記方法相比，ISSR具有多態(tài)性高、DNA用量少、操作簡單、成本低、可重復性好等特點[10]，鑒于此，本文基于ISSR分子標記技術比較分析了分屬于重樓屬13個種的13份種質資源的遺傳多樣性，以期為重樓屬植物鑒別、遺傳育種及其起源演化提供理論依據(jù)，為重樓屬野生資源的保護與合理利用提供科學的理論指導。

1?材料與方法

1.1?材料

供試的重樓品種共13份（見表1），均于2019年5月采自湖北省農科院中藥材研究所的重樓種質資源圃。采集的各重樓種質幼嫩葉片，經(jīng)硅膠干燥后放入液氮中保存?zhèn)溆谩NA提取采用CTAB法[11]。

1.2?ISSR分析

PCR擴增體系（25 μL）為：DNA模板約40 ng，10×Bufer 2.5 μl，primer 0.3 μmol·L-1，四種dNTPs各0.25 μmol·L-1，MgCl2 1.5 mmol·L-1，TaqDNA聚合酶1.25 U。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，然后進行35個循環(huán)：94 ℃變性45 s，55～62 ℃復性45 s，72 ℃延伸1.5 min;循環(huán)結束后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR結束后，將PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測。

1.3?數(shù)據(jù)分析

依據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖譜，在凝膠的某個相同遷移率位置上，如果有DNA條帶，賦值為“1”，無DNA條帶的賦值為“0”。利用POPGENE和NTsys-pc 2.1軟件對樣品進行遺傳多樣性分析，用非加權配對平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means）對所有樣品進行聚類分析。

2?結果與分析

2.1?引物篩選及多態(tài)性分析

以通用的ISSR引物為基礎，結合前人研究結果，利用24條ISSR引物進行PCR擴增，篩選出12條擴增條帶清晰、帶數(shù)較多、多態(tài)性良好且易于擴增的引物（表2）。由表3可知，12條引物對13個重樓樣品進行擴增，共分離出181條清晰條帶，擴增出174個多態(tài)位點，平均每個引物擴增出的多態(tài)位點為14.5個，其中6條引物的多態(tài)性比率達100%，平均多態(tài)百分數(shù)為96.13%。從單個引物擴增得到的多態(tài)位點來看，引物ISSR4擴增得到的多態(tài)位點最多，為18個。

2.2?遺傳多樣性分析

以篩選的12條引物分別擴增13份樣品的基因，結果顯示（表3）：樣品的觀察等位基因數(shù)（Na）范圍為1.857～2.000，有效等位基因數(shù)（Ne）范圍為1.365～1.533，Nei′s基因多樣性指數(shù)（H）范圍為0.214～0.327，香農指數(shù)（I）范圍為0.351～0.500，表明13個樣品間存在豐富的遺傳多樣性。

由重樓屬13份種質資源的ISSR標記數(shù)據(jù)矩陣可知（表4），樣品間的遺傳相似系數(shù)范圍為0.293～0.624，平均相似系數(shù)為0.452;遺傳距離范圍為0.536～0.746，平均遺傳距離為0.638，這說明供試的重樓屬種質間存在不同程度的遺傳變異，遺傳多樣性較高。其中相似性系數(shù)最大、遺傳距離最小的是毛重樓和凌云重樓;而長藥隔重樓和華重樓則有最小的相似性系數(shù)和最大的遺傳距離。

2.3?聚類分析

利用UPGMA聚類法對13份供試重樓屬植物進行了分析，基于遺傳距離矩陣構建了分子系統(tǒng)樹（見圖1）。當以平均遺傳距離（0.64）來劃分時，可分成三大類群：大類群Ⅰ為亮葉重樓、短瓣重樓、狹葉重樓和長瓣重樓4個品種;大類群Ⅱ為啟良重樓、多葉重樓、凌云重樓、金線重樓、長藥隔重樓、華重樓和矮重樓7個品種;大類群Ⅲ包括毛重樓和黑籽重樓2個品種。

3?討論

本試驗利用ISSR分子標記技術對13份重樓種質資源的遺傳多樣性進行了研究，從其遺傳距離和多態(tài)性來看，重樓種質間遺傳多樣性高，能準確反映基因組組成上的差異，這說明ISSR標記適用于重樓種質間的遺傳多樣性分析。尹曉蛟等[12]對13份重樓種質資源的表型遺傳多樣性進行了聚類分析，其研究結果與本文存在一定的差異，如從形態(tài)表現(xiàn)來看，短瓣球藥隔重樓和亮葉重樓的親緣關系較遠，而從ISSR的聚類結果顯示兩者間存在較近的親緣關系。重樓屬的分類研究中也并未表明短瓣球藥隔重樓和亮葉重樓有親緣關系，推測本研究中短瓣球藥隔和亮葉重樓在分子水平出現(xiàn)較高的相似性是因種質在同一栽培環(huán)境下長期繁育基因交流的結果。

根據(jù)李恒[13]基于形態(tài)學的重樓屬分類研究，本文中聚類的第Ⅱ類群包含的多葉重樓、金線重樓、凌云重樓同屬于重樓屬蚤休組，另外，啟良重樓、長藥隔重樓、華重樓、矮重樓又為多葉重樓的變種。顯然，第Ⅱ類群包含的全部7種重樓在重樓屬進化地位中位于較為原始的蚤休組。第Ⅲ類的毛重樓屬于蚤休組，黑籽重樓屬于黑籽組，二者表型上差異較大，ISSR的聚類結果卻將二者劃在同一組中，可能是因毛重樓和黑籽重樓在種質資源圃集中生長的過程中，發(fā)生了種間基因交流，獲得了相似的基因型[9]。

參?考?文?獻

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（責任編輯：唐?嵐）