李荔，孫蘋蘋，陳金亮，陳建榮，陶國(guó)華(南通市第一人民醫(yī)院.檢驗(yàn)科，.呼吸科，江蘇南通226001)

根據(jù)國(guó)家癌癥中心2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，肺癌位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病首位，占城市和農(nóng)村惡性腫瘤死亡率第一位[1]。肺癌根據(jù)病理類型可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)兩大類，肺癌中80%～85%是NSCLC[2-3]。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸，轉(zhuǎn)錄后通過識(shí)別靶miRNA 3′端非翻譯區(qū)(3′UTR)并與之互補(bǔ)結(jié)合，抑制miRNA的翻譯過程或促進(jìn)靶miRNA的降解，發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用[4]。研究表明，miRNA與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，它可作用于抑癌基因的靶點(diǎn)，使其表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤形成；也可作用于癌基因，阻止細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[5-7]。microRNA486(miR-486)屬于抑癌基因，與肺癌的發(fā)生、預(yù)后相關(guān)[8-10]。

呼出氣冷凝液(exhaled breath condensates，EBC)是一種生物液體，是呼吸道的天然基質(zhì)，DNA、RNA、蛋白質(zhì)、代謝物和揮發(fā)性化合物均可存在于EBC中。它是一種非侵入性采集的標(biāo)本，正逐漸受到重視。目前，對(duì)于腫瘤組織和血液中miRNA的研究報(bào)道較多，而EBC中肺癌標(biāo)志物的相關(guān)研究較少[11]。本研究旨在通過分析50例經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)的NSCLC患者EBC中miR-486的相對(duì)表達(dá)水平，并評(píng)價(jià)其在NSCLC中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選取2016年6月至2017年12月在我院呼吸科和胸外科接受治療并經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)為NSCLC的50例患者為研究對(duì)象，男27例，女23例，年齡42～83歲，中位年齡68.5歲。上述患者中鱗癌16例，腺癌34例，手術(shù)前均未接受放、化療及免疫治療、靶向治療。肺癌的臨床分期參考國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)2017年版NSCLC分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期4例，Ⅱ期17例，Ⅲ期18例，Ⅳ期11例。納入同期本院體檢健康者50例作為對(duì)照組，其中男28例，女22例，年齡34～78歲，中位年齡48歲。肺癌組和對(duì)照組年齡、性別及吸煙史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2017KY139)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2儀器和試劑 StepOne Plus熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，OneDrop 1000+微量分光光度計(jì)(日本松下電器公司)，EcoScreen冷凝器和Master Screen簡(jiǎn)易冷凝器(EricJaeger公司)，602全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(德國(guó)Roche公司)。miRNA提取分離試劑盒(批號(hào)R6529)、增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(批號(hào)R6519)、增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)R6510)均購(gòu)于北京天根公司。癌胚抗原(CEA，批號(hào)28657403)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA211，批號(hào)21374203)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自德國(guó)Roche公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集與處理 NSCLC患者于入院第1天采集外周血標(biāo)本。體檢健康者在體檢期間采集外周血標(biāo)本。用含促凝膠真空采血管采集研究對(duì)象靜脈血標(biāo)本5 mL，1 000×g離心10 min，分離血清樣品(≥500 μL)，用無RNase離心管分離后于-70 ℃保存?zhèn)溆?。用EcoScreen冷凝器或者M(jìn)aster Screen簡(jiǎn)易冷凝器預(yù)冷15 min，囑研究對(duì)象漱口、戴鼻夾，經(jīng)咬嘴平靜呼吸20 min后取出收集管，待標(biāo)本液化后可得到2～4 mL液體，即EBC；隨即放入無RNase離心管中，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。留取肺癌患者手術(shù)后的癌組織，經(jīng)液氮快速冷凍后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2總RNA的提取 采用miRNA提取分離試劑盒提取組織、血液和EBC標(biāo)本RNA。

1.3.3RNA含量和純度測(cè)定 按照OneDrop 1000+微量分光光度計(jì)操作手冊(cè)，對(duì)提取的RNA測(cè)定濃度及純度。評(píng)價(jià)RNA樣品純度，取A260 nm/A280 nm控制在1.8～2.1的樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4參照基因的選擇 本研究選擇在組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)且應(yīng)用最多的U6作為NSCLC患者組織中的參照基因。但由于目前U6等內(nèi)參基因在體液中的穩(wěn)定性尚存在爭(zhēng)議，因此本研究選取cel-miR-39作為血清和EBC中目的基因檢測(cè)時(shí)的參照基因。

1.3.5引物設(shè)計(jì) 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，miR-486、U6、cel-miR-39引物序列見表1，由北京天根公司合成。

表1 miR-486和參照基因引物序列

1.3.6反應(yīng)體系和條件 cDNA第一鏈合成：2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)至20 μL，42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min；PCR體系：cDNA 2 μL，miRNA熒光定量檢測(cè)試劑10 μL，引物終濃度200 mmol/L，反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，2 min；94 ℃，20 s；64 ℃，34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.7CEA、CYFRA211的檢測(cè) 按試劑盒說明書采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)CEA、CYFRA211。CEA參考區(qū)間：<5 μg/L。CYFRA211參考區(qū)間：<3.5 μg/L。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法處理后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料先做正態(tài)性檢驗(yàn)(K-S檢驗(yàn))；若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組數(shù)值比較采用t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。兩組計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值用ROC曲線分析。

2 結(jié)果

2.1血清miR-486、CEA、CYFRA211水平 見表2。K-S檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組miR-486、CEA、CYFRA211數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布(P<0.05)。Mann-WhitneyU檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與健康人對(duì)照組比較，NSCLC組血清miR-486表達(dá)水平降低(P<0.01)，而CEA、CYFRA211水平升高(P<0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2健康人對(duì)照組和NSCLC組血清miR-486、CEA、CYFRA211水平比較[M(P25，P75)]

分組nmiR-486CEA(μg/L)CYFRA211(μg/L)健康人對(duì)照組501.8(0.92,4.31)2.33(0.5,4.7)1.62(0.2,3.4)NSCLC組500.73(0.21,1.92)12.5(5.1,20.2)6.7(3.3,11.4)Z(P)值-3.058(<0.01)-8.593(<0.01)-10.058(<0.01)

2.2組織、血清和EBC中miR-486的表達(dá)水平 肺癌組織中miR-486的相對(duì)表達(dá)水平0.58(0.32,1.17)低于癌旁組織1.66(0.82,3.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.20，P<0.05)。肺癌組血清中miR-486的相對(duì)表達(dá)水平0.73(0.21,1.92)低于健康人對(duì)照組1.78(0.92,4.31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.68，P<0.05)。肺癌組EBC中miR-486的相對(duì)表達(dá)水平0.50(0.32,1.02)低于健康人對(duì)照組1.56(0.81,3.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.94，P<0.05)。

2.3不同TNM分期miR-486表達(dá)水平 不同TNM分期NSCLC患者組織、血清和EBC中miR-486相對(duì)表達(dá)水平見表3。Ⅲ～Ⅳ期患者組織、血清和EBC中miR-486相對(duì)表達(dá)水平均低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表3 不同TNM分期miR-486相對(duì)表達(dá)水平

2.4不同病理類型miR-486相對(duì)表達(dá)水平 不同病理類型NSCLC患者組織、血清和EBC中miR-486相對(duì)表達(dá)水平見表4。鱗癌患者組織、血清和EBC中miR-486相對(duì)表達(dá)水平與腺癌患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

表4 miR-486在不同病理類型中相對(duì)表達(dá)水平

2.5miR-486診斷NSCLC的價(jià)值 組織中miR-486的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.783，當(dāng)cut-off值取0.94時(shí)，敏感性為87%，特異性為70%。血清中miR-486的AUCROC為0.752，當(dāng)cut-off值取0.615時(shí)，敏感性為74%，特異性為72%。EBC中miR-486的AUCROC為0.792，當(dāng)cut-off值取1.08時(shí)，敏感性和特異性分別為92%和52%，miR-486與血清CEA、CYFRA211聯(lián)合篩查NSCLC時(shí)AUCROC為0.776，當(dāng)cut-off值取0.68時(shí)，敏感性和特異性分別為72%和78%。

3 討論

miR-486是一類在哺乳動(dòng)物中高度保守的miRNA，位于染色體8p11，是許多癌癥中基因組丟失的一個(gè)區(qū)域。本研究結(jié)果顯示，miR-486在NSCLC患者癌組織、血清及EBC中均呈低表達(dá)狀態(tài)。miR-486相對(duì)表達(dá)水平與NSCLC患者TNM分期有關(guān)，可能成為預(yù)測(cè)NSCLC患者預(yù)后的指標(biāo)，與畢雪冰等[12]研究結(jié)果一致。本研究中組織、血清和EBC miR-486的表達(dá)水平與病理細(xì)胞類型均無關(guān)，分析原因可能與樣本量少有關(guān)，需擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步研究。ROC曲線分析顯示，EBC中miR-486的檢測(cè)對(duì)于NSCLC患者敏感性較高，但是特異性不如組織和血清。EBC中miR-486和CEA、CYFRA211聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，AUCROC為0.776，當(dāng)cut-off值取0.68時(shí)，敏感性和特異性分別為72%和78%，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。本研究認(rèn)為，雖然EBC采集是一種無創(chuàng)、安全的技術(shù)，可以在整個(gè)隨訪過程中反復(fù)采集樣本而不會(huì)給患者帶來不適。但由于本研究樣本量較小，還需要進(jìn)行大規(guī)模多中心臨床研究來驗(yàn)證其有效性。