蘇建偉，周喜漢△，葉穎霞，蔣 旗

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科, 2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)科，廣西 百色 533000)

結(jié)腸癌屬于消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]，由于結(jié)腸癌多數(shù)早期沒有典型的臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多數(shù)處于進(jìn)展期和晚期，化療已成了結(jié)腸癌患者主要的治療方式。長(zhǎng)春新堿是目前臨床上常用抗結(jié)腸癌藥物，其主要機(jī)制是抑制有絲分裂紡錘體中的微管(microtubule)形成，導(dǎo)致中期階段的分裂細(xì)胞停滯，以發(fā)揮抗腫瘤作用[1]。但結(jié)腸癌患者長(zhǎng)期使用長(zhǎng)春新堿的毒副作用和耐藥性已成為結(jié)腸癌化療失敗的主要原因。中醫(yī)藥在治療腫瘤和逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥等方面的研究已成為臨床實(shí)驗(yàn)研究熱點(diǎn)[2-3]。苦參素(oxymatrine，OM)是一種從苦參、廣豆根中提取的生物堿，已有研究發(fā)現(xiàn)苦參素具有抗腫瘤作用，用于治療晚期肝癌患者，可改善機(jī)體全身狀況，延長(zhǎng)生命[4]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，苦參素對(duì)腫瘤的耐藥性也具有一定的逆轉(zhuǎn)作用[5]。馮云等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬及免疫應(yīng)答水平可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。關(guān)于苦參素能否逆轉(zhuǎn)結(jié)腸腫瘤對(duì)長(zhǎng)春新堿的耐藥，其機(jī)制是否與自噬及免疫應(yīng)答水平的表達(dá)相關(guān)，目前尚無深入的研究。本研究以人結(jié)腸癌耐長(zhǎng)春新堿細(xì)胞株(HCT-8/VCR)為研究對(duì)象，初步探討苦參素復(fù)合長(zhǎng)春新堿對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞耐藥性的影響及其機(jī)制，為臨床上結(jié)腸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HCT-8/VCR(人結(jié)腸癌耐長(zhǎng)春新堿的HCT-8細(xì)胞)購(gòu)自上海斯信生物公司；苦參素注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20057480)購(gòu)于江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司；長(zhǎng)春新堿注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H44021772購(gòu)于深圳萬樂藥業(yè)有限公司。青鏈雙抗、優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自HyClone公司1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購(gòu)自GIBICO公司，細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)、磷酸鹽緩沖鹽PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒采用CCK-8購(gòu)自上海翊圣公司；Anti-LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ兔單克隆抗體、Anti-SQSTM1/p62兔單克隆抗體、Anti-Beclin1兔單克隆抗體、Anti-TLR4鼠單克隆抗體購(gòu)自abcam公司；GAPDH鼠抗體購(gòu)自中杉金橋公司；預(yù)染marker、RIPA裂解液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、辣根過氧化物酶HRP-標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自碧云天公司；辣根過氧化物酶HRP-標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自博士德公司；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HCT-8/VCR用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HCT-8/VCR細(xì)胞生長(zhǎng)到80%時(shí)，以1.0×104cells/well，接種于96孔板中。實(shí)驗(yàn)分組分為空白組、苦參素單藥組，長(zhǎng)春新堿單藥組、苦參素和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合組，每組6個(gè)復(fù)孔。

1.3 CCK-8檢測(cè)各組的抑制率

苦參素組藥物濃度包括0.1 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、50 mg/ml。長(zhǎng)春新堿單藥組藥物濃度包括1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml?？鄥⑺睾烷L(zhǎng)春新堿聯(lián)合組藥物濃度包括：1 mg/ml苦參素和上述不同濃度的長(zhǎng)春新堿。給藥24 h后，每孔加入3 μl的CCK-8試劑，孵育2 h，450 nm處測(cè)定吸光度A。抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-本底組A值)/(對(duì)照A值-本底組A值)×100%。本實(shí)驗(yàn)用Graphpad prism 6.0軟件分別計(jì)算單藥組和聯(lián)合組處理HCT-8/VCR細(xì)胞24 h的IC50值。計(jì)算聯(lián)合組的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=不加苦參素的IC50/加入苦參素的IC50。

1.4 MDC法檢測(cè)各組細(xì)胞自噬體

采用1 mg/ml苦參素與1 μg/ml長(zhǎng)春新堿單獨(dú)或者聯(lián)合處理細(xì)胞，24 h后，離心收集培養(yǎng)基和細(xì)胞分別備用，采用Wash buffer清洗細(xì)胞后加入10 μl 單丹磺酰尸胺(dansylcadaverine，MDC)試劑，孵育45 min，再清洗2遍，加入100 μl的Collection buffer重懸細(xì)胞，滴加于載玻片上并加蓋玻片。采用熒光倒置顯微鏡拍照(激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512 nm)。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6的含量

按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)1.4方法中培養(yǎng)基的IL-6含量。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白和TLR4表達(dá)的情況

用RIPA裂解液冰上裂解1.4方法中各組的細(xì)胞，裂解完后4℃、13 000 r/min離心20 min，收集上清液，采用BCA試劑盒蛋白定量。取30～40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，I抗4℃過夜，再加入II抗室溫孵育1 h。最后用ECL曝光成像，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 苦參素復(fù)合長(zhǎng)春新堿對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞耐藥性的影響

HCT-8/VCR細(xì)胞在苦參素單藥組、長(zhǎng)春新堿單藥組作用24 h后的IC50值分別為34.16 mg/ml，17.63 μg/ml?？鄥⑺睾烷L(zhǎng)春新堿聯(lián)合組，長(zhǎng)春新堿的IC50值為5.462 μg/ml。由此可以得出，苦參素復(fù)合長(zhǎng)春新堿可降低HCT-8/VCR細(xì)胞的耐藥性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為3.23(圖1)。

2.2 苦參素復(fù)合長(zhǎng)春新堿對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞自噬形成的影響

與空白組比較，苦參素組和聯(lián)合組自噬體含量降低、長(zhǎng)春新堿組自噬體含量升高；聯(lián)合組與苦參素組比較，自噬體含量升高，聯(lián)合組與長(zhǎng)春新堿組比較，自噬體含量降低(圖2)。

Fig. 2 Effects of matrine on autophagy of HCT-8/VCR cells

2.3 苦參素復(fù)合長(zhǎng)春新堿對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6的影響

與空白組比較，苦參素組和聯(lián)合組HCT-8/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-6水平明顯降低(P<0.01)、長(zhǎng)春新堿組HCT-8/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-6水平明顯升高(P<0.01)；聯(lián)合組與苦參素組比較，HCT-8/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-6水平明顯降低(P< 0.01，表1)。

Tab. 1 Content of IL-6 in HCT-8/VCR cell culture medium

2.4 苦參素復(fù)合長(zhǎng)春新堿對(duì)HCT-8/VCR細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和TLR4表達(dá)的影響

自噬相關(guān)蛋白P62的表達(dá)情況為：與空白組比較，苦參素組P62的表達(dá)降低(P<0.05)，長(zhǎng)春新堿組和聯(lián)合組P62的表達(dá)升高(P<0.05)；聯(lián)合組與苦參素組和長(zhǎng)春新堿組比較，P62的表達(dá)均升高(P<0.05)。長(zhǎng)春新堿單藥和空白組相比，自噬相關(guān)蛋白P62的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。

LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1和TLR4的表達(dá)情況為：與空白組比較，苦參素組均表達(dá)升高(P<0.05)，長(zhǎng)春新堿組和聯(lián)合組均表達(dá)降低(P<0.05)；聯(lián)合組與苦參素組和長(zhǎng)春新堿組比較，表達(dá)均降低(P< 0.05。長(zhǎng)春新堿單藥和空白組相比LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1和TLR4的表達(dá)無明顯差異(P>0.05，圖3)。

Fig. 3 The expression levels of autophagy-related protein and TLR4 protein in HCT-8/VCR cells

3 討論

苦參素，分子式是C15H24N2O2·H2O，又稱為氧化苦參堿，是由豆科植物苦參的干燥根、植株、果實(shí)經(jīng)乙醇等有機(jī)溶劑提取制成的一類具有抗腫瘤、治療病毒性肝炎、抗肝纖維化、心肌炎等作用的生物堿[4-5]。目前Duo[7]等人研究表明1.00 mg/ml的苦參堿即可抑制肝癌細(xì)胞的惡性增殖，而且苦參堿作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖效果越顯著，本研究的結(jié)果與Duo等人的研究一致。在長(zhǎng)春新堿中，加入1.00 mg/ml～10.00 mg/ml的苦參素能顯著降低HCT-8/VCR細(xì)胞活力，隨著苦參素濃度的升高，抑制增殖效果越顯著。

自噬是機(jī)體自殺性死亡的一種形式，自噬在癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用。目前，研究表明，泛素結(jié)合蛋白P62、Bcl-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin-1)和微管相關(guān)蛋白1/輕鏈3(microtubule-associated protein1A/1 B-light chain 3，LC3)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬過程中也起著關(guān)鍵的作用[8]，其中LC3由可溶型LC3-Ⅰ和脂化型LC3-Ⅱ組成。本研究發(fā)現(xiàn)苦參素和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合組較單藥組，苦參素通過誘導(dǎo)P6表達(dá)，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表達(dá)，從而抑制HCT-8/VCR細(xì)胞的自噬。這與國(guó)內(nèi)外許多研究結(jié)果一致。許多研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證自噬相關(guān)基因的表達(dá)與多藥耐藥蛋白的相關(guān)性，直接抑制或敲除這些自噬相關(guān)基因，結(jié)果表明抑制自噬可增加腫瘤細(xì)胞的化療敏感性[9-11]。此外，Cen[12]等人研究表明腫瘤細(xì)胞自噬過程中細(xì)胞器內(nèi)PAMP會(huì)與TLR相互作用誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由此我們推測(cè)苦參素可能對(duì)HCT-8/VCR免疫應(yīng)答具有一定的抑制作用。

白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是腫瘤微環(huán)境中主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子之一。目前研究表明腫瘤細(xì)胞表達(dá)高水平IL-6，可激活相關(guān)傳導(dǎo)通路如JAK/STAT或NF-κB通路等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抗凋亡、誘導(dǎo)血管增生、細(xì)胞浸潤(rùn)和產(chǎn)生耐藥性[13]。本研究加入苦參素后，HCT-8/VCR細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6明顯降低，增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿藥物的敏感性。這與韓睿[14]等人研究結(jié)果一致，他們指出在肺癌裸鼠體內(nèi)降低IL-6的表達(dá)和分泌可以有效提高EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI藥物的敏感性。Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是目前研究最多的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)，不僅在免疫細(xì)胞表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞也有表達(dá)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫逃逸過程中發(fā)揮著重要的作用。在肝癌中研究還發(fā)現(xiàn)TLR4激動(dòng)劑LPS通過激活COX-2/PGE2信號(hào)軸，進(jìn)而激活STAT3通路，介導(dǎo)肝癌細(xì)胞的增殖及多藥耐藥的產(chǎn)生[15]。在乳腺癌中研究表明沉默TLR4降低紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞NF-κB、IL-6和VEGFa的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[16]?；谝陨涎芯靠梢酝茰y(cè)出抑制腫瘤細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的活化，降低免疫應(yīng)答水平，可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦參素和長(zhǎng)春新堿聯(lián)合組較單藥組相比，HCT-8/VCR活力降低的同時(shí)TLR4和IL-6的表達(dá)也降低。這與上述的推測(cè)是一致。

綜上所述：苦參素可以顯著逆轉(zhuǎn)HCT-8/VCR的耐藥性，其機(jī)制與抑制自噬活動(dòng)和抑制TLR4信號(hào)活化有關(guān)。