張曉金，張文霞，朱吉玲，羅文盼

(1.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，鹽城 224004；2.甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000；3.紹興文理學(xué)院，浙江 紹興 312000)

盡管人類(lèi)在乳腺癌治療方面已取得重大進(jìn)展，但乳腺癌仍然是最常見(jiàn)的癌癥之一，是全球婦女死亡的主要原因[1]。即使目前治療方法不斷進(jìn)步，但是乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然處于上升態(tài)勢(shì)[2]。乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的關(guān)鍵所在。目前普遍認(rèn)為，乳腺癌是一種多基因、多步驟參與的復(fù)雜疾病。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)機(jī)制一直以來(lái)都是探討惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的熱點(diǎn)話題。EMT是指在特定的生理、病理狀況下，上皮細(xì)胞會(huì)暫時(shí)失去極性，表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞所具有的遷移特征，即上皮細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞極性喪失、黏附能力下降及細(xì)胞拉長(zhǎng)等間質(zhì)表型特征。研究表明，EMT與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，乳腺癌細(xì)胞通過(guò)EMT獲得轉(zhuǎn)移遷移能力，侵襲周?chē)蜻h(yuǎn)處組織，成為轉(zhuǎn)移性腫瘤[3]。在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞頻繁出現(xiàn)上皮標(biāo)記蛋白(E-cadherin)表達(dá)水平降低，間質(zhì)標(biāo)記蛋白(N-cadherin)表達(dá)水平的上調(diào)[4],因此可以把這兩種免疫標(biāo)記物的表達(dá)情況作為細(xì)胞發(fā)生EMT的指標(biāo)。E-cadherin具有細(xì)胞黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的雙重作用，是維持上皮表型的重要黏附分子，該蛋白的缺失使細(xì)胞間的黏附下降，并促使β-連環(huán)蛋白發(fā)生易位，進(jìn)一步激活相關(guān)信號(hào)通路，最終誘導(dǎo)N-cadherin的表達(dá)上調(diào)，E-cadherin的下調(diào)及N-cadherin的高表達(dá)與腫瘤低分化、高侵襲力密切相關(guān)[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)信號(hào)傳導(dǎo)通路與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。例如，有研究表明cGAS可通過(guò)檢測(cè)微核，從而在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及監(jiān)控癌癥方面發(fā)揮重要作用[6]。本實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建高表達(dá)cGAS的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，探討cGAS通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移能力及EMT過(guò)程的作用機(jī)制,旨在尋求調(diào)控乳腺癌發(fā)展的新靶點(diǎn)，為臨床乳腺癌的診斷治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

乳腺癌MCF7細(xì)胞株購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)；

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(Gibco)、兔抗人cGAS單克隆抗體(Cell Signaling)、兔抗人STING單克隆抗體(Cell Signaling)、兔抗人單克隆抗體NF-κB(Cell Signaling)、兔抗人TANK單克隆抗體(Abcam)、兔抗人E-cadherin單克隆抗體(Abcam)、兔抗人N-cadherin單克隆抗體(Abcam)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG的抗體(碧云天)，MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司。cGAS載體構(gòu)建及慢病毒包裝由GenePharma公司完成。

1.3 建立穩(wěn)定高表達(dá)cGAS的細(xì)胞株及分組設(shè)計(jì)

將MCF7細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后均勻接種到12孔板中，設(shè)陰性對(duì)照組(NC組)和處理組(MCF7-cGAS)，處理組加入含cGAS的慢病毒，NC組加入等量空載慢病毒。培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到30%～40%時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)液，更換配置好的轉(zhuǎn)染混合液，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，更換正常培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后加入嘌呤霉素，篩選出穩(wěn)定高表達(dá)cGAS的細(xì)胞。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

將NC組細(xì)胞和處理組細(xì)胞消化后，接種于96孔板中，2 000 cells/well，嚴(yán)格控制細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)孔做4個(gè)重復(fù)，分別培養(yǎng)12 h，24 h，48 h，72 h，加入MTT(5.0 g/L)50 μl/well、置入培養(yǎng)箱孵育4 h，離心棄上清，加入二甲基亞砜200 μl，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光值，評(píng)價(jià)細(xì)胞存活率。酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

分別制備N(xiāo)C組和MCF7-cGAS組單細(xì)胞懸液(無(wú)血清培養(yǎng)液)，以1×105cells/ml加至24孔Transwell小室上部孔中，下部腔室中加入50 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，收集穿過(guò)下室并鋪展在下膜表面上的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)每個(gè)膜的遷移細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算遷移率，遷移率(%)=(遷移細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)

1.6 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取NC組及MCF7-cGAS組細(xì)胞提取蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度并將樣本蛋白稀釋至適宜濃度，SDS-PAGE電泳2 h，轉(zhuǎn)膜1.5 h，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌后加二抗孵育1 h，β-actin做內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建高表達(dá)cGAS 的乳腺癌細(xì)胞系的鑒定

將對(duì)照空載體病毒和高表達(dá)cGAS慢病毒分別感染MCF7細(xì)胞48 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)，并用嘌呤霉素篩選2周，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)各組細(xì)胞GFP陽(yáng)性率均在90%以上。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果也表明MCF7細(xì)胞感染后cGAS蛋白表達(dá)增高，結(jié)果表明成功構(gòu)建MCF7-cGAS細(xì)胞系(圖1)。

Fig. 1 Effective lentiviral vector were transfected into breast cancer cells MCF7

2.2 cGAS高表達(dá)對(duì)MCF7細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

將對(duì)照組和MCF7-cGAS組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h后，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞，與對(duì)照組相比，MCF7-cGAS組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變(圖2)。細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?，該特征為癌?xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表現(xiàn)之一。

Fig. 2 Effects of cGAS over expression on morphological characteristics of MCF7 cells(×200)

2.3 cGAS高表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF7-cGAS組細(xì)胞在12 h、24 h、48 h、72 h的OD值(分別為0.379±0.012，0.516±0.019,0.854±0.032,1.154±0.027)均顯著高于對(duì)照組細(xì)胞對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的OD值(0.221± 0.009，0.383±0.017，0.648±0.024，0.904±0.019，P<0.05，圖2)。

Fig. 3 Effects of cGAS overexpression on viability of MCF7 cells n=3)

2.4 cGAS高表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

MCF7-cGAS細(xì)胞組在48 h的遷移率為 61.58%，明顯高于對(duì)照組的遷移率28.9%(P< 0.05，圖4)。

Fig. 4 Effects ofcGAS overexpression on migration of MCF7 cells by transwell assay(×200)

2.5 cGAS高表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與NC組相比，MCF7-cGAS細(xì)胞組EMT標(biāo)記蛋白E-cadherin的表達(dá)水平降低，N-cadherin表達(dá)水平增高(P<0.05，圖5，表2)。

Fig. 5 Expressions of E-cadherin and N-cadherin detected by Western blot

Tab. 1 Relative protein expressions of E-cadherin and N-cadherin in the MCF7 cells by Western blot n=3)

3 討論

cGAS-STING信號(hào)通路最初是作為天然免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分被發(fā)現(xiàn)，其功能是檢測(cè)胞漿DNA的存在，并在反應(yīng)中觸發(fā)炎癥基因的表達(dá)[7-9]。之前諸多研究主要探索cGAS在固有免疫細(xì)胞中的功能與調(diào)節(jié)機(jī)制，近年來(lái)的研究顯示cGAS在腫瘤中也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。當(dāng)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)DNA泄露后，易被cGAS識(shí)別，激活下游IFN應(yīng)答[10]。Ⅰ型IFN應(yīng)答能夠作為刺激腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵誘導(dǎo)劑, 且其上游cGAS-STING信號(hào)通路也可以在特定階段促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在非炎性路易斯肺癌(Lewis lung cancer，LLC)小鼠模型中cGAS-STING通路激活與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)[11]。本研究結(jié)果顯示，cGAS高表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示其在乳腺癌中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

新近研究發(fā)現(xiàn)染色體不穩(wěn)定性通過(guò)維持腫瘤細(xì)胞對(duì)胞質(zhì) DNA 的自主反應(yīng)來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)移。染色體不穩(wěn)定的癌細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量DNA 碎片通過(guò)微核分泌到細(xì)胞質(zhì)中，一旦細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn) DNA 碎片，就會(huì)激活 cGAS-STING 通路，但隨后不會(huì)激活經(jīng)典的 NF-κB 通路。相反，cGAS-STING 通路會(huì)激活非經(jīng)典的 NF-κB 通路，促使 p52 基因的表達(dá)，使癌細(xì)胞的基因表達(dá)特征與骨髓先天性免疫細(xì)胞具有某些相似性，并且可逃避 T 細(xì)胞的追殺，抑制cGAS-STING 通路可顯著抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。cGAS-STING 信號(hào)的激活也會(huì)刺激 PD-L1 在癌細(xì)胞中表達(dá)，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞的免疫逃逸[13]。Chen 等發(fā)現(xiàn)連接蛋白43和原鈣黏蛋白7介導(dǎo)cGAMP 通過(guò)縫隙連接從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨后誘導(dǎo)IFN和NF-κB的表達(dá), 促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移[14]。本研究中cGAS高表達(dá)后增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腫瘤性上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過(guò)程，是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要步驟。例如，在關(guān)于胃癌和髓母細(xì)胞瘤的研究報(bào)道，減緩EMT進(jìn)程，可抑制癌細(xì)胞侵襲[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)，cGAS高表達(dá)可增加N-cadherin表達(dá)，降低E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)EMT進(jìn)程，這可能是cGAS促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制之一，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究證實(shí)cGAS高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌MCF7的增殖和遷移能力，揭示cGAS與細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)。在后續(xù)研究中，我們將深入探討cGAS-STING通路對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響及機(jī)制，為臨床乳腺癌靶向治療提供理論依據(jù)。