范有壽，邱志勝，趙亞萍

(1.金昌市第一人民醫(yī)院外一科，甘肅 金昌 737100；2.甘肅省人民醫(yī)院腫瘤外科，蘭州 730000；3.金昌市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，甘肅 金昌 737100)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計胃癌已成為嚴(yán)重威脅人類健康的第二大常見癌癥，其發(fā)病率和死亡率均較高[1]。雖然胃癌的診斷和治療已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但由于胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移且治療效果不盡如人意，其5年總生存率仍較低[2, 3]。因此，進(jìn)一步探究胃癌的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新的治療方法對提高患者的治療水平和改善預(yù)后具有重要意義。

硫氧還蛋白還原酶1(thioredoxin reductase 1，TrxR1)是一種硒蛋白，能通過NADPH依賴的方式促進(jìn)硫氧還蛋白1(thioredoxin 1，Trx1)的還原。TrxR1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育和抗氧化應(yīng)激的作用，參與腫瘤的生長和耐藥。有研究發(fā)現(xiàn)TrxR1在口腔鱗癌、腦膜瘤和非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤分期和預(yù)后有關(guān)[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TrxR1能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性[7]。沉默TRXR1能抑制肝癌細(xì)胞增值和遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。上述研究表明TRXR1是惡性腫瘤診療的潛在靶點，但其在胃癌中的作用研究較少。因此，本文探究TRXR1在胃癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，并通過細(xì)胞實驗探究其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為臨床治療胃癌提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

組織標(biāo)本：76例胃癌及對應(yīng)的癌旁組織均來源于2013年1月至2014年4月期間在金昌市第一人民醫(yī)院接收手術(shù)治療的患者。其中，男性56名，女性20名，年齡20～56歲。所有患者術(shù)前未接受放療和化療。所有患者的胃癌及癌旁組織部分保存于10%多聚甲醛溶液中固定至少24 h后行石蠟包埋，部分組織置于液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存用備用。所有病例依據(jù)國際癌癥控制聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)第七版胃癌TNM分級標(biāo)準(zhǔn)分期[9]。術(shù)后對生存患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止于2019年7月。本研究經(jīng)我院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

主要材料與試劑：胃癌細(xì)胞株AGS、MKN-45、HGC-2及永生化人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胃癌細(xì)胞株MGC-803購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC；TRIzol、LipofectAMINE2000和RPMI 1640液體培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；SYBR Premix ExTaq Ⅱ試劑盒和實時熒光定量PCR SYBR Green試劑盒均購自日本TaKaRa公司；PierceTMBCA Protein Assay試劑盒、ECL染色試劑均購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔抗人TRXR1多克隆抗體(bs-8299R)、兔抗人cyclinD1多克隆抗體(bs-0623R)、兔抗人C-Myc多克隆抗體(bs-4963R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TRXR1 siRNA干擾序列及陰性對照(NC-siRNA)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

AGS細(xì)胞株培養(yǎng)于Ham's F-12細(xì)胞培養(yǎng)液，MKN-45、MGC-803、HGC-2、GES-1細(xì)胞株培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(均含10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素)，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行傳代或進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以4×105cells/well接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期，更換培養(yǎng)液。根據(jù)處理方法不同將AGS細(xì)胞分為3組：陰性對照組、TRXR1 siRNA干擾1組(TRXR1 siRNA1組)和TRXR1 siRNA干擾2組(TRXR1 siRNA2組)。根據(jù)siRNA設(shè)計原則，針對TRXR1基因序列設(shè)計兩條siRNA序列(TRXR1-siRNA1和TRXR1-siRNA2)并送至上海吉瑪生物科技有限公司合成。根據(jù)Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明將TRXR1 siRNA干擾序列1(TRXR1-siRNA1)、TRXR1 iRNA干擾序列2(TRXR1-siRNA2)及陰性對照序列(NC-siRNA)分別轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞，轉(zhuǎn)染至48 h后，收集細(xì)胞，提取總RNA和總蛋白，用qRT-PCR和Western blot法檢測各組細(xì)胞中TRXR1 mRNA和蛋白表達(dá)量。

1.4 Real-time PCR檢測TrxR1 mRNA表達(dá)水平

用RNA提取試劑盒提取胃癌組織及細(xì)胞中總RNA，用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA作為模板，行實時熒光定量PCR，以β-actin為內(nèi)參。TrxR1上游引物5’-AGC TCA GTC CAC CAA TAG TGA-3’，下游引物5’-GGT ATT TTT CCA GTC TTT TCA T-3′。β-actin上游引物：5’-CAC CCG CGA GTA CAA CCT TC-3’，下游引物：5’-CCC ATA CCC ACC ATC ACA CC-3’。反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸40 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt值表示TRXR1 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

組織標(biāo)本常規(guī)包埋，5 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，PBS沖洗，檸檬酸鹽抗原熱處理20 min，添加兔抗人TrxR1抗體(1∶500)，37℃濕盒中孵育過夜，PBS沖洗，添加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)，37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，PBS沖洗，復(fù)染，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.6 蛋白印跡法檢測TRXR1、c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)水平

用TRIzol提取胃癌組織及癌旁組織中總蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，按每孔50 μg蛋白質(zhì)行10% SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后，將分離到的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉30 min，分別加入兔抗人TrxR1多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人cyclinD1多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗人C-Myc多克隆抗體(1∶500)及兔抗人β-actin多克隆抗體(1∶2 000)，4℃反應(yīng)過夜，用PBST洗膜3次，每次10 min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜，采用電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以TRXR1蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示TRXR1蛋白的相對表達(dá)水平。

1.7 克隆集落形成實驗

取對數(shù)生長期的陰性對照組、TrxR1基因沉默1組和TrxR1基因沉默2組AGS細(xì)胞，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按1×105cells/well接種于6孔板，培養(yǎng)1周后，甲醛溶液固定細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察克隆數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.8 MTT法檢測TRXR1沉默對細(xì)胞增殖能力的影響

取對數(shù)生長期的陰性對照組、TrxR1基因沉默1組和TrxR1基因沉默2組AGS細(xì)胞，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，按8 000 cells/well接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入20 μl終濃度為5 mg/ml的MTT，繼續(xù)孵育4 h后，離心除去上清液，加入150 μl DMSO，置搖床上低速震蕩混勻，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測各孔吸光度值(OD)。每組設(shè)6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TRXR1在胃癌組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，TrxR1蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)，TrxR1蛋白在胃癌組織中表達(dá)量顯著高于癌旁組織(圖1A)，Western blot實驗結(jié)果顯示，3例胃癌組織中TrxR1蛋白表達(dá)量顯著高于對應(yīng)的癌旁組織表達(dá)量(圖1B)；此外，用qRT-PCR檢測收集的76例胃癌組織及癌旁組織中TrxR1 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示，胃癌組織中TrxR1 mRNA表達(dá)(3.45±1.01)顯著高于癌旁組織(0.83±0.30，P<0.01)。

Fig. 1 Relative expression levels of TRXR1 in gastric cancer and adjacent tissues(n=3)

2.2 TRXR1 mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

以76例胃癌組織TrxR1 mRNA表達(dá)量的平均值3.45為界，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中，TrxR1 mRNA表達(dá)量≥3.45為高表達(dá)組(n=37)，TrxR1 mRNA表達(dá)量<3.45為低表達(dá)組(n=39)，比較兩組患者年齡、性別、腫瘤位置、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度的差異，并對生存時間進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，TNM分期越高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者TrxR1 mRNA表達(dá)越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)；Kaplan-Meier分析顯示，TrxR1低表達(dá)組患者中位生存期為45(34～54)個月，TrxR1高表達(dá)組患者中位生存期為35(21～45)個月，與TrxR1低表達(dá)組相比，TrxR1高表達(dá)組患者中位生存期較短(P<0.01)。

Tab. 1 Relationship between TrxR1 mRNA expression and clinicopathological features

2.3 TRXR1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)

為了驗證胃癌組織中的檢測結(jié)果，進(jìn)一步檢測了4株胃癌細(xì)胞系MGC-803、AGS、MKN-45、HGC-2及1株永生化人胃粘膜上皮細(xì)胞系GES-1中TRXR1的表達(dá)量，結(jié)果如表2所示，胃癌細(xì)胞中TrxR1 mRNA表達(dá)量均顯著高于其在永生化人胃粘膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá)量(P<0.01)，其中AGS細(xì)胞系中TRXR1表達(dá)量最高，因此，后續(xù)實驗用AGS細(xì)胞系研究TrxR1對胃癌細(xì)胞增殖的影響。

Tab. 2 Expression of TrxR1 in gastric cancer cell n=3)

2.4 TrxR1沉默細(xì)胞的建立

將構(gòu)建的TrxR1 siRNA1、TrxR1 siRNA2和NC-siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞AGS，轉(zhuǎn)染48 h后收集RNA和總蛋白，檢測TRXR1 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，與NC-siRNA組相比，TRXR1 siRNA1和TRXR1 siRNA2組細(xì)胞中TRXR1 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.01，表3)。

Tab. 3 Expressions of TrxR1 mRNA and protein in AGS cells after TrxR1 n=3)

2.5 TrxR1沉默對AGS細(xì)胞增殖能力的影響

將處于生長對數(shù)期的由TrxR1 siRNA1和TrxR1 siRNA2構(gòu)建的TRXR1沉默胃癌細(xì)胞AGS以1×105cells/well接種于6孔板，培養(yǎng)1周后在倒置顯微鏡下攝片，進(jìn)行單克隆計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TrxR1 siRNA1組和TrxR1 siRNA2組AGS細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目少于NC-siRNA組的細(xì)胞數(shù)目，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。

將處于生長對數(shù)期的TRXR1沉默及陰性對照組的胃癌細(xì)胞AGS以8 000 cells/well接種于96孔板，分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h后，MTT試驗結(jié)果顯示，基因沉默TrxR1后，細(xì)胞增殖能力被明顯抑制，培養(yǎng)48～96 h時與NC-siRNA組相比，結(jié)果均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05，表4)。上述結(jié)果提示，TrxR1基因沉默能抑制AGS細(xì)胞的增殖。

Tab. 4 The effect of TrxR1 silencing on the proliferation of AGS n=3)

2.6 TRXR1沉默對AGS細(xì)胞c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)的影響

Western blot試驗結(jié)果顯示，與NC-siRNA組相比，TRXR1 siRNA1組和TRXR1 siRNA2組AGS細(xì)胞中c-Myc和cyclinD1蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05，表5)。這一結(jié)果提示，TRXR1基因沉默能抑制AGS細(xì)胞中與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白c-Myc和cyclinD1表達(dá)。

Tab. 5 Effects of TrxR1 silencing on the expressions of c-myc and cyclinD1 in AGS n=3)

3 討論

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)系統(tǒng)是人體主要的抗氧化系統(tǒng)之一，由Trx1、TrxR和NADPH組成。其主要作用是參與調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化還原反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)和免疫應(yīng)答[10]。TrxR是二聚體黃素酶，與細(xì)胞的增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中，根據(jù)分布部位不同，將TrxR分為TrxR1和TrxR2兩種，其中，TrxR1表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，TrxR2主要表達(dá)于線粒體中[11]。研究發(fā)現(xiàn)，TrxR1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且TrxR1高表達(dá)與腫瘤分期、患者預(yù)后及耐藥有關(guān)[11, 12]。然而，TrxR1與胃癌的關(guān)系尚沒有被報道。

本研究中，我們首先通過免疫組化法檢測3例胃癌組織及癌旁組織中TrxR1蛋白的表達(dá)及定位，發(fā)現(xiàn)TrxR1在胃癌組織中高表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)。同時，用Western blot法也檢測3例胃癌組織及癌旁組織中TrxR1蛋白的表達(dá)，檢測結(jié)果也表明TrxR1蛋白在胃癌組織中表達(dá)量顯著性高于癌旁組織。此外，用RT-PCR法檢測收集的76例胃癌組織及癌旁組織中TrxR1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌組織TrxR1 mRNA表達(dá)量明顯升高。冉冬梅和高豐厚[13]研究發(fā)現(xiàn)TrxR1在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)中高表達(dá)。另有研究發(fā)現(xiàn)，TrxR1在前列腺癌患者血清中明顯升高，且其與患者的不良預(yù)后相關(guān)[4]。有學(xué)者認(rèn)為TrxR1升高誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是肝癌發(fā)生的主要決定因素之一[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，TrxR1表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者病理分期相關(guān)，晚期膠質(zhì)瘤組織TrxR1表達(dá)量明顯高于早期膠質(zhì)瘤組織[14]。本研究中，我們比較胃癌組織TrxR1表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)胃癌TNM分期越高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織TrxR1蛋白表達(dá)水平較高。Kaplan-Meier分析顯示，TRXR1與胃癌患者預(yù)后負(fù)相關(guān)。為進(jìn)一步明確TRXR1在胃癌中的表達(dá)情況，檢測4株胃癌細(xì)胞系及1株永生化人胃粘膜上皮細(xì)胞系中TRXR1的表達(dá)情況，結(jié)果同樣顯示，TRXR1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量也升高。以上研究結(jié)果表明，TRXR1在胃癌中高表達(dá)，TRXR1高表達(dá)也是胃癌患者預(yù)后不良的危險因素，其可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。

TRXR1對腫瘤細(xì)胞增殖的影響越來越受到人們關(guān)注。Yin等[15]報道，過表達(dá)TRXR1能抑制化療藥物誘導(dǎo)的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌凋亡。另有研究報道，過表達(dá)TrxR1能顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性[7]。He等[16]研究發(fā)現(xiàn)，土木香內(nèi)酯能通過抑制TRXR1活性，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡。目前，開發(fā)新的TrxR1抑制劑作為潛在的抗癌藥物已被人們的普遍認(rèn)可。為了深入探究TRXR1對胃癌增殖的影響，我們首先構(gòu)建兩條TRXR1干擾序列，RT-PCR和Western blot實驗顯示，TRXR1 siRNA1和TRXR1 siRNA2均能顯著性抑制胃癌細(xì)胞中TRXR1的表達(dá)，提示成功建立TRXR1沉默細(xì)胞模型。進(jìn)一步研究TRXR1沉默對胃癌細(xì)胞克隆形成數(shù)目的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC-siRNA組相比，TRXR1 siRNA1和TRXR1 siRNA2組的細(xì)胞克隆數(shù)顯著性減少。進(jìn)一步研究TRXR1沉默對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因沉默TRXR1可明顯降低胃癌細(xì)胞的增殖能力。以上結(jié)果表明，TRXR1能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長增殖。TRXR1基因沉默對胃癌細(xì)胞增殖活力的影響可能與胃癌細(xì)胞中氧化應(yīng)激有關(guān)。正常生理條件下，細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，ROS生成過多或清除不足導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，引起DNA氧化損傷，促使細(xì)胞凋亡。研究表明，腫瘤細(xì)胞中ROS水平高于正常細(xì)胞，故癌細(xì)胞抵抗ROS的能力較弱，易受活性氧的影響。因此，提高ROS水平是一種非常重要的腫瘤治療方法。一些臨床抗癌藥物，如索拉非尼、順鉑和三氧化二砷都可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。越來越多的研究表明，抑制TrxR1活性能破壞ROS生成和清除的動態(tài)平衡，促進(jìn)ROS生成增多，誘發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，引起DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

c-myc蛋白是一種真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對細(xì)胞周期重要的調(diào)控因子能與Max結(jié)合成二聚體，c-Myc/Max二聚體復(fù)合物與DNA核心序列結(jié)合調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括細(xì)胞周期、代謝、凋亡[17]。Cyclin D1是一種核蛋白，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞G1期的調(diào)控。Cyclin D1通過結(jié)合并激活CDK4，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因(retinoblastoma，Rb)的蛋白產(chǎn)物pRb磷酸化，進(jìn)而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，使細(xì)胞由G1期向S期過渡，使細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRXR1基因沉默的胃癌細(xì)胞中c-myc和cyclin D1蛋白水平顯著性降低，提示基因沉默TRXR1能影響胃癌細(xì)胞中與周期相關(guān)的蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖。

綜上所述，胃癌組織中TrxR1高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，基因沉默TRXR1能抑制胃癌細(xì)胞的增值，調(diào)控機(jī)制可能與抑制周期相關(guān)蛋白c-myc和cyclin D1表達(dá)有關(guān)，提示TRXR1可能是胃癌治療的靶基因，為胃癌的的治療提供實驗依據(jù)及新的思路。但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。