王宣傲

（北京市順義牛欄山第一中學(xué)，北京 101301）

0.引言

20 世紀(jì)80 年代，“基因功能及其調(diào)控”逐漸成為基因研究的重點。一系列研究結(jié)果表明，物種的復(fù)雜性與基因組中編碼基因的數(shù)量之間沒有相關(guān)性：果蠅的編碼基因數(shù)量比圓蟲少很多，而水稻植物的基因比人類多。研究人員發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)調(diào)控與物種的復(fù)雜性有一定的關(guān)系?；虮磉_(dá)調(diào)控不僅與轉(zhuǎn)錄、翻譯這些生理過程相關(guān)，而且與表觀遺傳調(diào)控有一定的關(guān)系。不過，當(dāng)時的科學(xué)家尚不清楚基因表達(dá)調(diào)控的具體機(jī)制。

在研究植物的過程中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，一些分子量較小的RNA 可以有效地抑制基因的表達(dá)，他們將這種現(xiàn)象命名為“有義共抑制”（也被稱為轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后基因沉默）。更深入的研究表明，與RNA 合成和降解相關(guān)的酶與基因沉默息息相關(guān)。RNA 依賴RNA 聚合酶（RdRp）可以將有義轉(zhuǎn)錄本作為模板，產(chǎn)生雙鏈RNA（dsRNA），并觸發(fā)RNA 沉默。向細(xì)胞中注射反向重復(fù)DNA 序列或通過其他方式提高細(xì)胞中dsRNA 分子的水平，也會抑制相關(guān)基因的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)是十分驚人的，因為當(dāng)時的科學(xué)家?guī)缀鯊奈纯紤]過，可以通過改變細(xì)胞質(zhì)中特定RNA 的水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。許多國家的研究人員對這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究，他們發(fā)現(xiàn)，在原生生物、絲狀真菌、無脊椎動物以及脊椎動物中，都存在類似的現(xiàn)象。由于這些具有雙鏈結(jié)構(gòu)的RNA 可以干擾基因的表達(dá)，科學(xué)家將其稱為小干擾RNA（siRNA），將這種干擾現(xiàn)象稱為RNA 干擾。

幾十年來，RNA 干擾領(lǐng)域不斷取得重大進(jìn)展，科學(xué)家設(shè)計了許多種含有不同堿基的siRNA，從而提高其在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，提高干擾效率。RNA 干擾技術(shù)在農(nóng)業(yè)、科研、醫(yī)療等領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。一些從事生物醫(yī)學(xué)研究的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，向人體中注入特定的siRNA，可能有助于抑制某些基因的表達(dá)，使患者更快地恢復(fù)健康。許多研究人員發(fā)現(xiàn)，與反義寡核苷酸相比，siRNA 對核酸酶更具抵抗力，并且治療效果更好。將siRNA 高效地遞送到各種細(xì)胞系和原代細(xì)胞中后，它們可以高效地發(fā)揮作用。將siRNA 注入人體后，siRNA 可以使幾乎任何與疾病相關(guān)的靶基因沉默，這為遺傳病和自身免疫病等基因相關(guān)疾病的治療提供了新思路。深入分析RNA 干擾技術(shù)的研究進(jìn)展及其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用，有助于人們更高效地治療一些棘手的慢性遺傳病、慢性傳染病等。

1.RNA 干擾的研究歷史

20 世紀(jì)80、90 年代，一些科學(xué)家在研究基因的過程中，開展了多項與DNA 和RNA 相關(guān)的實驗。一些科學(xué)家在研究RNA 的性質(zhì)的過程中，發(fā)現(xiàn)了RNA 干擾現(xiàn)象（RNAi）。研究人員在使用體外合成的RNA 進(jìn)行反義研究時，發(fā)現(xiàn)了與經(jīng)典的反義抑制理論相矛盾的結(jié)果：注射了正義RNA 和反義RNA 的細(xì)胞具有相似的表型。Craig Mello 及其同事也在實驗中發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，他們將這種現(xiàn)象命名為“RNA 干擾”（RNAi），以區(qū)別于經(jīng)典的反義抑制。此外，Mello 還注意到這些短鏈RNA 可以擴(kuò)散到注射部位附近的其他組織，這表明干擾RNA 可以跨越細(xì)胞界限，在不同組織間長距離傳遞和維持。不過，當(dāng)時的科學(xué)家無法確定這種現(xiàn)象是由哪種RNA 引起的[1]。

在20 世紀(jì)90 年代初，華盛頓卡內(nèi)基研究所胚胎學(xué)系的安德魯·費爾（Andrew Fire）發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA（dsRNA）可以高效地降解秀麗隱桿線蟲中的特定mRNA，而反義RNA則沒有這種功能。Fire 認(rèn)為，由于體外合成反應(yīng)中使用的病毒RNA 聚合酶可以催化多種反應(yīng)，應(yīng)用質(zhì)粒模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時，體系中可能不僅含有正義RNA 和反義RNA，也含有dsRNA。也就是說，制得的RNA 產(chǎn)物可能是被dsRNA 污染的。Fire 用單鏈RNA（ssRNA）和dsRNA 的純化制備物檢驗了這一假設(shè)。用凝膠純化ssRNA 后，注射這些ssRNA 并不能使動物產(chǎn)生相應(yīng)的表型。他們將正義鏈和反義鏈在體外退火，得到了一些dsRNA，將這些dsRNA 注入動物后，動物體內(nèi)的一些mRNA 會相對較快地降解，且這種降解具有較高的特異性。這些研究人員還發(fā)現(xiàn)，降解最快的mRNA 序列與dsRNA 的正義鏈?zhǔn)窒嗨芠2]。

這些研究表明，dsRNA 可能與mRNA 降解和基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)，后來，一些科學(xué)家對這一現(xiàn)象進(jìn)行了更加深入的研究。他們發(fā)現(xiàn)， dsRNA 分子可以以同源依賴的方式降解靶標(biāo)mRNA。較長的dsRNA 可被Dicer 酶（一種dsRNA 特異性核酸內(nèi)切酶）切割，產(chǎn)生長度為21 ～23bp的小干擾RNA（siRNA）。Dicer-siRNA 可以與TAR RNA結(jié)合蛋白（TRBP）發(fā)生相互作用，并形成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），降低特定基因的表達(dá)水平。此外，RISC還可以與argonaute 2（Ago2）發(fā)生相互作用，后者是一種效應(yīng)核酸酶，它也可以在5'端切割靶mRNA，使靶mRNA降解為較短的片段，無法翻譯為蛋白質(zhì)。這些研究結(jié)果表明，具有特定序列的雙鏈RNA 可以高效地降解mRNA，干擾基因的表達(dá)。后來，生物科學(xué)研究者將這類現(xiàn)象統(tǒng)一稱作RNA 干擾[3]。

2. RNA 干擾技術(shù)的研究進(jìn)展

2.1 siRNA 合成

目前，我們通常用化學(xué)方法合成siRNA，或者從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取siRNA。然而，這些siRNA 的干擾效率，有時并不理想。如何改進(jìn)siRNA 合成技術(shù)，是一個十分重要的問題。一些研究人員連接了解旋酶結(jié)合組成性轉(zhuǎn)運元件（CTE）基序和Bcl2 的反義寡核苷酸，并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，他們發(fā)現(xiàn)，與解旋酶偶聯(lián)的雜合寡核苷酸的干擾效果更好，雜合寡核苷酸可以更高效地募集細(xì)胞解旋酶，并改善寡核苷酸與目標(biāo)序列的結(jié)合情況。

2.2 基于載體的siRNA 表達(dá)

用化學(xué)方法合成的siRNA 的成本很高，且所合成的siRNA 活性較低。我們可以利用各種啟動子表達(dá)盒，將細(xì)胞變成siRNA 合成工廠。一些研究人員成功地利用哺乳動物細(xì)胞合成siRNA，降低了siRNA 的生產(chǎn)成本。

此外，利用載體生產(chǎn)的siRNA 活性較高，能夠穩(wěn)定地抑制靶基因的表達(dá)。因此，利用這些siRNA，我們可以完成實驗周期較長的基因功能分析。

研究人員常常利用Pol III 啟動子（例如U6 snRNA，H1和tRNA）表達(dá)siRNA。首先，在天然狀態(tài)下，細(xì)胞利用Pol III 啟動子轉(zhuǎn)錄相對較小的RNA，例如tRNA 和snRNA。其次，Pol III 啟動子在G 或A 處開始轉(zhuǎn)錄。利用Pol III，我們可以預(yù)先確定siRNA 的起始位點，也可以隨時將需要的序列插入轉(zhuǎn)錄起始位點的下游，從而得到目的產(chǎn)物。此外，利用Pol III，我們可以高效地控制RNA 的聚合過程，只需要向培養(yǎng)基中加入四環(huán)素或Cre-loxP，就可以改變細(xì)胞中siRNA 的表達(dá)水平。因此，我們通常利用這種啟動子，研究瞬時表達(dá)基因或致死基因的功能[4]。

目前，可以通過兩種方法，在體內(nèi)表達(dá)特定的siRNA。第一種方法是，采用Pol III 啟動子，指導(dǎo)小的反向重復(fù)序列的合成，這些重復(fù)序列由可變長度的間隔區(qū)隔開，合成的RNA 包含特定的靶序列、環(huán)序列（3 ～9nu）和30U 突出端的莖，這些RNA 會在酶的輔助下形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。體內(nèi)的Dicer 酶會進(jìn)一步加工這些短發(fā)夾RNA（shRNA），使其發(fā)揮作用。第二種方法是，將兩個U6 啟動子串聯(lián)在同一個載體中，或放在兩個單獨的載體中，從而指導(dǎo)靶向序列和含30-UUUU 突出端的小RNA 的轉(zhuǎn)錄。有義鏈和反義鏈將在體內(nèi)形成雙鏈體，其功能類似于體外的siRNA。大多數(shù)研究表明，這兩種方法都可以產(chǎn)生高活性的siRNA，高效抑制靶基因的表達(dá)。不過，在低濃度下，發(fā)夾型siRNA表達(dá)載體的抑制活性明顯高于串聯(lián)型siRNA 表達(dá)載體。此外，科學(xué)家嘗試對發(fā)夾型靶序列進(jìn)行修飾，這些修飾不影響其活性，但可以提高其在細(xì)菌內(nèi)的穩(wěn)定性。我們還可以通過其他方法，優(yōu)化載體結(jié)構(gòu)，從而改變所合成的siRNA的活性?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，由tRNA（Val）或U6 啟動子驅(qū)動的siRNA 的活性存在一定的差異，tRNA-siRNA 的轉(zhuǎn)錄本比U6-siRNA 更穩(wěn)定，而且tRNA-siRNA 在Dicer 酶的作用下可以產(chǎn)生更多的siRNA[5]。

一些科學(xué)家利用CMV 啟動子，成功地在培養(yǎng)的細(xì)胞中合成了有效的siRNA[6]。為了構(gòu)建該基于Pol II 啟動子的系統(tǒng)，他們將發(fā)夾序列引入CMV 啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點，并使用特定的終止子序列，及時終止轉(zhuǎn)錄。除Pol III 啟動子外，我們還可以應(yīng)用其他啟動子（如Pol II 啟動子）合成siRNA。大量研究表明，Pol II（CMV）和Pol III（tRNAVal）特異性啟動子可以成功地抑制哺乳動物細(xì)胞中的螢光素酶報告基因。一些科學(xué)家開發(fā)了載體pDECAP，從而提高siRNA 的表達(dá)效率。這種載體可以高效地表達(dá)來自RNA 聚合酶II（Pol II）啟動子的長雙鏈RNA（dsRNA）。pDECAP的轉(zhuǎn)錄本既沒有50 帽結(jié)構(gòu)，也沒有30-poly（A）尾部，轉(zhuǎn)錄出的dsRNA 可以快速到達(dá)細(xì)胞質(zhì)[7]。因此，這種載體可以高效地降低特定基因的表達(dá)水平，為研究細(xì)胞、組織及整個動物系統(tǒng)中的基因功能提供了新思路。

3. RNA 干擾技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 治療疾病

應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)，醫(yī)療工作者可以高效地治療病毒性疾病和腫瘤。雖然目前多數(shù)研究僅在哺乳動物細(xì)胞系和動物模型中進(jìn)行，但可以預(yù)見的是，隨著RNA 干擾技術(shù)的逐步成熟，其必將成為人類戰(zhàn)勝難治性遺傳病、感染性疾病的有力武器。

研究表明，RNA 干擾技術(shù)可以在體內(nèi)有效抑制人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、鼠丙種皰疹病毒和人免疫缺陷病毒的復(fù)制。不過，一些病毒可能會迅速地變異，導(dǎo)致導(dǎo)入的siRNA 不能有效地與其結(jié)合。

RNA 干擾技術(shù)也在腫瘤的治療過程中發(fā)揮著重要的作用。許多國家的腫瘤生物學(xué)實驗室和生物制藥公司致力于研究siRNA 的功能，并將其作為整體藥物開發(fā)策略的一部分。一些研究人員發(fā)現(xiàn)，靶向結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系survivin 基因的siRNA 可以抑制腫瘤的生長。這一發(fā)現(xiàn)是十分令人興奮的。它可能為治療結(jié)腸癌提供新思路。與目前的基因療法臨床試驗相似，在siRNA 治療技術(shù)到達(dá)臨床試驗階段后，科學(xué)家需要采取所有適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)患者的措施（如獨立審查、自愿知情同意等），保障患者在接受siRNA 治療過程中的權(quán)利。不可置疑的是，前沿的病毒載體傳遞方法是較為有效的，但是如何提高其安全性，避免這些siRNA在進(jìn)入人體后產(chǎn)生不良反應(yīng)，是一個頗具挑戰(zhàn)性的問題。

3.2 預(yù)防疾病

肉類安全問題一直是人們重點關(guān)注的問題。研究表明，牲畜疾病嚴(yán)重地威脅著肉類的安全。如何更有效地預(yù)防動物患病，控制傳染性疾病的傳播，是農(nóng)牧業(yè)科研人員面臨的重大挑戰(zhàn)。RNAi 技術(shù)在疾病的預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用。在研究預(yù)防口蹄疫（FMD）的策略以及控制流感病毒H1N1 的方法時，研究人員都需要應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)，研究某一干預(yù)方法對疾病傳播和動物健康狀況的影響。2014年，一些研究人員通過向受精卵中注射siRNA，成功地獲得了對PRRSV 特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因(TG)豬，經(jīng)過TG 豬與NTG 對照發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)siRNA 表達(dá)使豬血清HP-PRRSV 含量顯著降低 ，并且增加3d 的存活時間，RNAi 技術(shù)為家畜抵抗病毒感染提供可能性。

4.結(jié)語

RNA 干擾技術(shù)是一項十分重要的誘導(dǎo)基因沉默的技術(shù)。深入研究其作用機(jī)理，實現(xiàn)特定時間內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控和組織特異性表達(dá)，是未來的主要研究方向。此外，科學(xué)家還需對siRNA 在人體中的代謝過程進(jìn)行深入的研究，從而減輕siRNA 治療的副作用，使其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用更廣泛。