程 瑩 李浩卓 張婷婷 王建華 孫 群*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/種子科學與技術(shù)研究中心，北京 100193；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 農(nóng)作物種子全程技術(shù)研究北京創(chuàng)新中心，北京 100193)

確保種子質(zhì)量檢測結(jié)果準確是保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全用種的關(guān)鍵所在[1-2]。種子發(fā)芽試驗是種子檢驗等相關(guān)科研工作的重要內(nèi)容，在種子生物學研究、種子質(zhì)量管理[3]、實現(xiàn)良種化[4]和種子質(zhì)量標準化等方面具有極其重要的意義。

目前實驗室常用的標準發(fā)芽法為砂床發(fā)芽法與紙床發(fā)芽法[5-6]。采用砂床發(fā)芽法，霉菌感染和擴散的情況能得到一定抑制，但砂子清選、消毒和拌砂過程繁瑣，占用空間大，前期計數(shù)與紙床相比非常不便，并且由于砂子含水量的差異，會增加重復間的誤差。有研究比較發(fā)芽盒法和卷紙發(fā)芽法檢測小麥種子活力的穩(wěn)定性，其結(jié)果表明卷紙發(fā)芽法發(fā)芽勢和發(fā)芽率普遍高于發(fā)芽盒法，不同重復之間的變異系數(shù)也顯著低于發(fā)芽盒法[7]。但有研究在采用標準發(fā)芽試驗或逆境萌發(fā)試驗檢測種子活力時，所需時間較長，在此期間種子活力易受到霉變及人為操作影響[8-9]。進行卷紙發(fā)芽前，需要提前對種子進行消毒處理，由于消毒不徹底或者內(nèi)部帶菌等問題，在種子發(fā)芽期間亦會有霉變現(xiàn)象，造成不同檢驗室、不同發(fā)芽環(huán)境或不同檢驗員之間難以獲得完全一致的檢測結(jié)果。目前，在標準發(fā)芽過程中，既保證發(fā)芽結(jié)果的穩(wěn)定性與準確性，又簡化種子消毒流程的方法尚未見報道。

本研究借鑒芽苗菜的培育方法[10-11]，制作新型噴淋發(fā)芽箱，在不同條件下進行種子標準卷紙發(fā)芽試驗和噴淋發(fā)芽試驗，測定并比較2種發(fā)芽檢測方法發(fā)芽指標以及帶菌率等指標，旨在提升玉米和小麥種子發(fā)芽試驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，以期為建立規(guī)范的噴淋式發(fā)芽檢測方法提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

玉米(ZeamaysL.)種子：‘鄭單958’和‘農(nóng)大87’，生產(chǎn)年份為2017年，均產(chǎn)自甘肅省。

小麥(TriticumaestivumL.)種子：‘濟麥22’，生產(chǎn)年份為2018年；‘山農(nóng)21’，生產(chǎn)年份為2016年，均產(chǎn)自山東省。

1.2 試驗方法

1.2.1噴淋發(fā)芽箱的設計與制作

裝置為立方體箱狀，規(guī)格為：包括3×2組噴淋頭，塑料軟管，水泵和定時器。噴淋箱材質(zhì)為透明塑料，有助于光的透射。由水泵連接軟管，將水泵接入噴淋頭進行噴淋。水泵連接定時器，定時器定時供電，可以使水泵定時開啟，從而定時噴淋。箱底帶有水槽，可以使噴淋后的水分從出水孔流出，經(jīng)塑料軟管回流至水桶中，見圖1。

1.儲水裝置；2.進水管；3.水泵；4.排水管；5.噴淋頭1.Water container; 2.Inlet pipes; 3.Water pump; 4.Drain pipes; 5.Spraying head圖1 噴淋發(fā)芽箱示意圖Fig.1 Schematic diagram of spraying germination box

1.2.2噴淋時間間隔對種子發(fā)芽的影響

1)提前1 d將蒸餾水放入發(fā)芽室(25 ℃)中進行溫度平衡；

2)在潤濕至飽和的海綿上覆蓋同樣潤濕至飽和的發(fā)芽紙，夾在2個14.5 cm×14.5 cm的底部有篩孔的發(fā)芽盒中，將蒸餾水浸過的種子均勻放置在發(fā)芽盒內(nèi)，置床時各粒種子之間留有一定距離，以保證幼苗的生長空間和減少霉菌的傳染。玉米每盒50粒種子，小麥每盒100粒種子，設置3次重復；

3)將發(fā)芽盒置于噴淋發(fā)芽箱內(nèi)，設置不同的噴淋間隔處理：玉米每隔3、6 和8 h噴淋1次，每次噴淋持續(xù)1 min；小麥每隔4、6 和8 h噴淋1次，每次噴淋持續(xù)1 min。在噴淋箱內(nèi)放置溫度計，每日檢測發(fā)芽箱內(nèi)溫度，保證發(fā)芽箱內(nèi)溫度與發(fā)芽室中相同；

4)發(fā)芽第4天統(tǒng)計發(fā)芽勢，發(fā)芽結(jié)束后(玉米第7天，小麥第8天)統(tǒng)計發(fā)芽率、帶菌種苗數(shù)，并稱量幼苗鮮重，計算簡易活力指數(shù)(SVI)。

發(fā)芽勢=(4 d內(nèi)正常發(fā)芽種子粒數(shù)/
參加試驗種子總數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽率=(7或8 d內(nèi)正常發(fā)芽種子粒數(shù)/
參加試驗種子總數(shù))×100%

(2)

簡易活力指數(shù)(SVI)=發(fā)芽率×S

(3)

式中：S，7或8 d內(nèi)正常幼苗的平均重量，g。

1.2.3噴淋發(fā)芽結(jié)果穩(wěn)定性驗證

以1.2.2中確定的時間間隔對不同玉米和小麥種子進行發(fā)芽試驗，以《種子學實驗技術(shù)》[12]中的標準卷紙發(fā)芽方法作為對照。

種子帶菌率=(帶菌種苗數(shù)/參加試驗種子總數(shù))×
100%

(4)

1.2.4低質(zhì)量種子(高溫高濕老化處理獲得)噴淋發(fā)芽結(jié)果穩(wěn)定性驗證

1)將準備老化的玉米/小麥種子稱重，隨后放入尼龍網(wǎng)袋中，做好標記；

2)向干燥器內(nèi)加入適量蒸餾水，使水面距離篩面約2 cm。將尼龍網(wǎng)袋放入干燥器中，用凡士林密封干燥器，并將其放入烘箱內(nèi)，設置人工老化處理溫度，玉米種子為45 ℃，小麥種子為41 ℃，相對濕度100%；

3)老化4 d后取出種子，在室溫下風干至原始重量；

4)每個重復玉米取50粒、小麥取100粒種子進行卷紙發(fā)芽試驗與噴淋發(fā)芽試驗，3次重復。

1.2.5不同測試時間噴淋發(fā)芽結(jié)果穩(wěn)定性驗證

玉米間隔3個月，小麥間隔1個月，重復噴淋發(fā)芽與卷紙發(fā)芽的對比試驗，同時將不同測試時間的噴淋發(fā)芽與卷紙發(fā)芽得到的結(jié)果進行對比。

1.2.6不同人員操作噴淋發(fā)芽結(jié)果穩(wěn)定性驗證

實驗室不同人員重復噴淋發(fā)芽與卷紙發(fā)芽的對比試驗，同時將不同人員操作的噴淋發(fā)芽與卷紙發(fā)芽得到的指標進行對比。

1.2.7數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Excel 2007和IBM SPSS Statistics 23.0軟件，運用單因素方差分析對發(fā)芽數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴淋發(fā)芽間隔時間的確定

由表1可知，每隔3、6 和8 h噴淋1次，‘鄭單958’玉米種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率與標準卷紙發(fā)芽法相比無顯著差異，種子帶菌率則顯著低于標準卷紙發(fā)芽法；隨著噴淋時間間隔的增長，‘鄭單958’玉米幼苗的SVI有下降趨勢，因此選擇每間隔 3 h 噴淋1次的時間間隔進行后續(xù)的試驗。

每隔4、6 和8 h噴淋1次，‘濟麥22’小麥種子的發(fā)芽勢與標準卷紙發(fā)芽法相比顯著提高，種子帶菌率則顯著低于標準卷紙發(fā)芽法；隨著噴淋時間間隔的增加，‘濟麥22’小麥幼苗的SVI有下降趨勢，因此選擇每間隔4 h噴淋1次的時間間隔進行后續(xù)的試驗。

表1 不同噴淋間隔時間玉米和小麥種子發(fā)芽檢測結(jié)果Table 1 Different spraying intervals on maize seeds and wheat seeds germination tested result

2.2 不同噴淋間隔對其他玉米和小麥種子發(fā)芽的驗證

由表2可知，對‘農(nóng)大87’玉米種子進行間隔 3 h 的噴淋發(fā)芽，分別與標準卷紙發(fā)芽(種子消毒)、卷紙發(fā)芽(種子未消毒)相比，噴淋發(fā)芽的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均無顯著差異，而種子帶菌率顯著降低。對‘山農(nóng)21’小麥種子進行間隔4 h的噴淋發(fā)芽，分別與標準卷紙發(fā)芽(種子消毒)、卷紙發(fā)芽(種子未消毒)相比，噴淋發(fā)芽的發(fā)芽率、SVI無顯著差異，而種子帶菌率相比卷紙發(fā)芽(種子未消毒)顯著降低。

表2 不同噴淋時間間隔對不同玉米和小麥種子發(fā)芽結(jié)果的影響Table 2 Effect of different spraying intervals on seed germination result of maize seeds and wheat seeds

2.3 高溫高濕老化處理玉米和小麥種子噴淋發(fā)芽結(jié)果驗證

由表3可知，經(jīng)過老化后的2個品種的玉米種子，發(fā)芽率和SVI與表1和表2中結(jié)果相比顯著降低。雖然帶菌率顯著增加，但采用噴淋發(fā)芽法，種子帶菌率顯著低于卷紙發(fā)芽法。噴淋發(fā)芽法的發(fā)芽率、SVI與標準卷紙發(fā)芽法相比沒有顯著差異。

表3 玉米和小麥人工老化種子噴淋發(fā)芽試驗結(jié)果Table 3 Spraying germination test result of maize seeds and wheat seeds after artificial aging treatment

經(jīng)過老化處理的2個品種的小麥種子，雖然帶菌率顯著增加，但采用噴淋發(fā)芽法，‘濟麥22’種子帶菌率仍顯著低于卷紙發(fā)芽法，2個品種噴淋發(fā)芽法的發(fā)芽率、SVI與標準卷紙發(fā)芽法相比無顯著差異。

2.4 不同測試時間種子噴淋發(fā)芽試驗對比

由表4可知，在間隔3個月后對2個品種的玉米種子進行間隔3 h的噴淋發(fā)芽，‘鄭單958’和‘農(nóng)大87’在不同檢測時間噴淋發(fā)芽檢測之間的SVI保持穩(wěn)定，2次結(jié)果無顯著差異；而采用卷紙發(fā)芽檢測，雖然2個品種發(fā)芽率穩(wěn)定，但是2次檢測結(jié)果中帶菌率差異顯著，且‘農(nóng)大87’卷紙發(fā)芽種子帶菌率顯著高于噴淋發(fā)芽結(jié)果。

在間隔1個月后對2個品種的小麥種子進行間隔4 h的噴淋發(fā)芽檢測，‘濟麥22’和‘山農(nóng)21’噴淋發(fā)芽檢測的發(fā)芽率、帶菌率和SVI保持穩(wěn)定，2次結(jié)果無顯著差異。而采用卷紙發(fā)芽法檢測，不同檢測時間2個品種發(fā)芽率、SVI無顯著差異；而‘山農(nóng)21’種子帶菌率在不同檢測時間存在顯著差異，且‘濟麥22’卷紙發(fā)芽的種子帶菌率顯著高于噴淋發(fā)芽結(jié)果。

表4 不同測試時間玉米和小麥種子噴淋發(fā)芽試驗結(jié)果對比Table 4 Comparison of spraying germination test result of maize seeds and wheat seeds at different testing time

2.5 不同人員操作噴淋發(fā)芽試驗對比

由表5可知，2個品種的玉米種子在不同人員操作下，各處理的發(fā)芽率均無顯著差異，同時噴淋發(fā)芽的種子帶菌率均處于較低的水平，表明噴淋發(fā)芽法能較為穩(wěn)定地緩解玉米種子在發(fā)芽過程中的染菌現(xiàn)象。

2個品種的小麥種子在不同人員操作下，各處理的發(fā)芽率均無顯著差異，同時噴淋發(fā)芽的種子帶菌率均處于較低的水平，表明噴淋發(fā)芽法能較為穩(wěn)定地緩解小麥種子在發(fā)芽過程中的染菌現(xiàn)象。

2.6 噴淋發(fā)芽法穩(wěn)定性評價

綜上所述，對于玉米種子，不同測試時間、不同人員操作的噴淋發(fā)芽法與卷紙發(fā)芽法雖然在發(fā)芽率上無顯著差異，但卷紙發(fā)芽法在不同測試時間、不同人員操作下的帶菌率差異顯著，而噴淋發(fā)芽法的結(jié)果更穩(wěn)定一致。對于小麥種子，不同測試時間和不同人員操作的噴淋發(fā)芽法與卷紙發(fā)芽法雖然在發(fā)芽率上無顯著差異，但卷紙發(fā)芽法在不同測試時間和不同人員操作下的帶菌率差異顯著，而噴淋發(fā)芽法的結(jié)果更穩(wěn)定一致。

表5 不同人員操作噴淋發(fā)芽結(jié)果對比Table 5 Comparison of spraying germination result operated by different personnel

3 討論與結(jié)論

時偉芳等[7]比較卷紙發(fā)芽法和紙上發(fā)芽法的穩(wěn)定性，認為逆境萌發(fā)率是較為穩(wěn)定的種子活力檢測指標，卷紙發(fā)芽檢測結(jié)果穩(wěn)定性顯著優(yōu)于紙上發(fā)芽，這是因為卷紙發(fā)芽法重復間的水勢基本能保持一致。但卷紙發(fā)芽法需要提前對種子進行消毒處理，即便如此，由于種子內(nèi)部帶菌，仍會造成種子間的相互侵染影響最終的檢測結(jié)果。有些種子，比如甜玉米種子，采用常規(guī)濃度次氯酸鈉消毒處理時，種子活力會出現(xiàn)一定程度的下降，有可能是次氯酸鈉影響了胚細胞的活性。噴淋發(fā)芽法是芽苗菜培育最常用到的育苗方法，比如芽苗菜立體無土栽培生產(chǎn)方式——托盤噴淋栽培技術(shù)[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，花生、黃豆和綠豆種子每4 h噴水1次[14-15]，香椿種子每 6 h 噴水1次[16]，豌豆種子每12 h噴水1次[17]，可以生產(chǎn)出質(zhì)量較佳的芽苗菜。

本研究設計制作的噴淋發(fā)芽箱，通過定時定量噴水，保證發(fā)芽期間水勢均衡，通過沖淋可以及時沖洗掉萌發(fā)的孢子，從而可以省掉種子消毒環(huán)節(jié)。玉米種子適宜的噴淋間隔時間為3 h，小麥種子適宜的噴淋間隔時間為4 h，每次噴淋時間均為1 min。不同作物、不同品種的試驗均表明噴淋發(fā)芽法的發(fā)芽檢測結(jié)果與卷紙發(fā)芽法(種子消毒)結(jié)果一致，重復間的變異系數(shù)均<5%，并且噴淋發(fā)芽方法種子帶菌率顯著下降，即使檢測高帶菌率的種子，噴淋發(fā)芽過程中種子帶菌率也處于較低水平。不同人員操作和不同檢測時間，采用噴淋發(fā)芽法，檢測結(jié)果之間的穩(wěn)定性要優(yōu)于卷紙發(fā)芽法。本研究以其他玉米品種(‘農(nóng)大86’和‘農(nóng)大364’)和小麥品種(‘周麥18’和‘山農(nóng)11’)進行驗證，不同測試時間和不同人員操作獲得的發(fā)芽率穩(wěn)定一致，變異系數(shù)均<2%，且任意2次試驗間的差距均低于《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程：發(fā)芽試驗(GB/T 3543.4—1995)》[18]中關(guān)于“同一或不同實驗室來自相同或不同送驗樣品間發(fā)芽試驗的容許差距”。噴淋發(fā)芽法(種子無需預消毒)多次試驗的帶菌率均值4.6%，顯著低于卷紙發(fā)芽法(種子預消毒)的21.2%。

綜上，噴淋發(fā)芽法穩(wěn)定性很高，且相比卷紙發(fā)芽法而言，能顯著降低玉米和小麥種子的帶菌率，省去提前消毒環(huán)節(jié)，為那些對消毒藥劑敏感的作物及品種提供了更加可靠穩(wěn)定的發(fā)芽檢測方法。

另外，新收獲的小麥種子有休眠現(xiàn)象[19]，而通過干濕交替處理[20]或通過流水處理稀釋種子表面萌發(fā)抑制劑[21]，能夠解除小麥種子的休眠。本試驗發(fā)現(xiàn)，采用噴淋發(fā)芽法，‘濟麥22’的發(fā)芽勢及發(fā)芽率均顯著高于標準卷紙發(fā)芽法，這可能就是由于新收獲的小麥種子存在休眠，而噴淋能夠沖去種子表面的萌發(fā)抑制物質(zhì)，從而解除種子的休眠。