陳菲菲，趙長青，王世超，馮嬌

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

鑒于當(dāng)代人越來越強(qiáng)的保健意識(shí)，發(fā)酵類食品因其豐富的營養(yǎng)價(jià)值而受到關(guān)注。發(fā)酵肉制品中富含的有益微生物可產(chǎn)生乳酸、乳酸菌素等代謝產(chǎn)物，降低了肉制品的pH，對(duì)致病菌和腐敗菌形成競(jìng)爭性抑制作用[1]；在發(fā)酵的同時(shí)還會(huì)降低肉品水分含量，這些能夠提高肉制品安全性并延長其貨架期。豬肉作為最通用的食材，其蛋白質(zhì)含量高，而脂肪、膽固醇含量相對(duì)較低，味道鮮美而且營養(yǎng)價(jià)值豐富[2]，因而將豬肉進(jìn)行發(fā)酵制成休閑食品是一大趨勢(shì)。比如將豬肉制成發(fā)酵香腸已有許多研究[3-6]，而火腿也是豬肉比較常見的一種加工方式，現(xiàn)也有相關(guān)報(bào)道[7-9]，對(duì)火腿中菌群進(jìn)行了分析和篩選，現(xiàn)在比較受歡迎的豬肉脯也可見相關(guān)研究[10]。在西方國家如美國、德國、意大利等已經(jīng)有較成熟的發(fā)酵肉制品的人工發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)并且已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[11]，研究發(fā)現(xiàn)攝入乳酸桿菌和含活性乳酸菌的食品會(huì)使乳酸菌定植到人的大腸內(nèi)，繼續(xù)發(fā)揮作用，從而形成抑制有害菌增殖的環(huán)境，有利于協(xié)調(diào)人體腸道內(nèi)微生物菌群的平衡[12]。

傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的豬肉干多會(huì)添加發(fā)色劑硝酸鹽、亞硝酸鹽和防腐劑等，雖然市場(chǎng)上產(chǎn)品按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行添加，攝入量較小，但畢竟存在安全隱患[13]。而發(fā)酵豬肉干因具有特有的風(fēng)味、便捷、營養(yǎng)、不添加任何防腐劑、開發(fā)潛力巨大等優(yōu)勢(shì)，逐漸受到越來越多消費(fèi)者的青睞和歡迎。如今利用乳酸菌作為功能性發(fā)酵劑，將豬肉發(fā)酵制成發(fā)酵豬肉干的嘗試也逐漸成為一種新的休閑肉制品加工方法。目前研究延長發(fā)酵肉制品的貨架期方面已有報(bào)道[14,15]。本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)發(fā)酵豬肉干風(fēng)味等方面已經(jīng)進(jìn)行過相關(guān)研究[16]，為了將發(fā)酵豬肉干向工業(yè)生產(chǎn)方向發(fā)展，還需要對(duì)發(fā)酵豬肉干的貨架期進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過探索不同的發(fā)酵條件(接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間)和烘烤條件(烘烤溫度、烘烤時(shí)間)，研究如何延長嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的貨架期，以微生物指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)，確定出貨架期最長的發(fā)酵豬肉干工藝條件，為發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)和微生物控制提供了參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬肉、白砂糖、鹽、菜籽油、醬油、姜、高溫蒸煮袋:市售；葡萄糖、乳糖：分析純，成都市科龍化工試劑廠；牛肉浸膏、蛋白胨、氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 菌株

實(shí)驗(yàn)用嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏，使用前在乳酸菌培養(yǎng)基上活化24 h。

1.1.3 儀器與設(shè)備

HH-6D數(shù)顯恒溫水浴鍋、SHP-80生化培養(yǎng)箱 常州普天儀器制造有限公司；JA5003電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；V1000型可見分光光度計(jì) 翱藝儀器(上海)有限公司；DHG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C數(shù)字酸度計(jì) 成都方舟科技開發(fā)有限公司；SKY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；DZQ4/2E真空包裝機(jī) 溫州奔騰機(jī)械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)

1.2.1 發(fā)酵豬肉干加工工藝流程

發(fā)酵液的制備→原料肉預(yù)處理→初煮→復(fù)煮→滅菌→接種→發(fā)酵→烘烤→包裝→滅菌→儲(chǔ)藏。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

通過對(duì)發(fā)酵條件和烘烤條件進(jìn)行優(yōu)化，目的是探索出貨架期較長的發(fā)酵豬肉干的工藝條件。本實(shí)驗(yàn)以前期研究得到的感官指標(biāo)較好的發(fā)酵豬肉干作為對(duì)照組，其工藝條件為：接種量5%、發(fā)酵時(shí)間36 h、發(fā)酵溫度30 ℃、烘烤溫度95 ℃、烘烤時(shí)間75 min。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵條件(接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間)和烘烤條件(烘烤時(shí)間、烘烤溫度)的優(yōu)化步驟如下。

1.2.2.1 接種量的優(yōu)化

在發(fā)酵時(shí)間36 h、發(fā)酵溫度30 ℃、烘烤溫度95 ℃、烘烤時(shí)間75 min的情況下，分別取接種量1%、2.5%、5%、7.5%、10%(V/V)，以考察接種量對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

在接種量5%、發(fā)酵時(shí)間36 h、烘烤溫度95 ℃、烘烤時(shí)間75 min的情況下，分別取發(fā)酵溫度20，25，30，35，40 ℃，以考察發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.3 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

在接種量5%、發(fā)酵溫度30 ℃、烘烤溫度95 ℃、烘烤時(shí)間75 min的情況下，分別取發(fā)酵時(shí)間12，24，36，48，60 h，以考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.4 烘烤時(shí)間的優(yōu)化

在接種量5%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間36 h、烘烤溫度95 ℃的情況下，分別取烘烤時(shí)間為70，75，80，85 min，以考察烘烤時(shí)間對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.2.5 烘烤溫度的優(yōu)化

a.不同溫度下含水率小于且最接近20%的烘烤時(shí)間的測(cè)定

按照國家標(biāo)準(zhǔn)，肉干類制品含水率不得超過20%[17]。為了既能達(dá)到國家要求，又能使豬肉干具有較好口感，實(shí)驗(yàn)需首先測(cè)得不同溫度(75，85，95，105 ℃)下發(fā)酵豬肉干含水率小于且最接近20%的烘烤時(shí)間。

b.最優(yōu)烘烤溫度的確定

在接種量5%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間36 h的情況下，改變烘烤溫度(各烘烤溫度下對(duì)應(yīng)的烘烤時(shí)間為豬肉干含水率小于且最接近20%的烘烤時(shí)間)，取值分別為75，85，95，105 ℃，以考察烘烤溫度對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響。

1.2.3 發(fā)酵豬肉干微生物指標(biāo)檢測(cè)

按照肉干的國家標(biāo)準(zhǔn)，通過檢測(cè)嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干中微生物指標(biāo)(包括菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌)來確定其貨架期，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)見表1。即：本次實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵豬肉干的微生物檢測(cè)采取三級(jí)采樣方案，按照三級(jí)采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在同一批發(fā)酵豬肉干的5個(gè)樣品中，允許全部樣品中菌落總數(shù)≤104CFU/g、大腸桿菌數(shù)≤10 CFU/g；允許有≤2個(gè)樣品的菌落總數(shù)在104～105CFU/g之間、大腸桿菌數(shù)在10～102CFU/g之間，不允許有樣品的菌落總數(shù)>105CFU/g、大腸桿菌數(shù)>102CFU/g；任何一個(gè)樣品不得檢出致病菌(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌)[18]。

其中，菌落總數(shù)的檢測(cè)參照GB 4789.2-2016操作；大腸菌群的檢測(cè)參照GB 4789.3-2016操作；沙門氏菌的檢測(cè)參照GB 4789.4-2016操作；金黃色葡萄球菌的檢測(cè)參照GB 4789.10-2016操作；志賀氏菌的檢測(cè)參照GB 4789.5-2012操作。

表1 發(fā)酵豬肉干微生物指標(biāo)[19]

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響

2.1.1 接種量對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響

表2 不同接種量下豬肉干的微生物檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，當(dāng)發(fā)酵豬肉干儲(chǔ)藏溫度為30 ℃時(shí)，未發(fā)酵的豬肉干在儲(chǔ)藏3 d時(shí)長出了致病菌沙門氏菌,在儲(chǔ)藏2 d時(shí)微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，所以未發(fā)酵豬肉干的貨架期為2 d；接種量為5%的未優(yōu)化發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏7 d時(shí)長出了致病菌金黃色葡萄球菌；接種量為2.5%和7.5%的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏7 d時(shí)長出了致病菌金黃色葡萄球菌；接種量為10%的豬肉干在儲(chǔ)藏13 d時(shí)最高的微生物菌落總數(shù)為1.35×105CFU/g，超過了微生物上限值105CFU/g，而且長出了致病菌金黃色葡萄球菌，以上均不符合儲(chǔ)藏要求，被淘汰。接種量為1%的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏16 d時(shí)長出了金黃色葡萄球菌，在儲(chǔ)藏13 d時(shí)微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，所以未發(fā)酵豬肉干的貨架期為13 d，是接種量優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中貨架期最長的。因此，可以確定1%為嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的最優(yōu)接種量。相比較未發(fā)酵的豬肉干(2 d)，其貨架期延長了11 d，主要是因?yàn)樵诖私臃N量下可以促進(jìn)嗜酸乳桿菌新陳代謝，將糖類或糖類物質(zhì)分解產(chǎn)生有機(jī)酸、乙醇等物質(zhì)，進(jìn)而抑制有害微生物(脂解菌和朊解菌等)的生長繁殖活動(dòng)[20]，從而使有害菌的生長不能大量進(jìn)行，所以延長了發(fā)酵豬肉干的儲(chǔ)藏時(shí)間。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響

表3 不同發(fā)酵時(shí)間下豬肉干的微生物檢測(cè)結(jié)果

由表3可知，發(fā)酵時(shí)間為12，24，36 h的發(fā)酵豬肉干在7 d時(shí)都長出了致病菌金黃色葡萄球菌，按照國家標(biāo)準(zhǔn)這些樣品被淘汰。儲(chǔ)藏到第10天時(shí)，發(fā)酵時(shí)間為48 h的發(fā)酵豬肉干長了致病菌沙門氏菌，說明該樣品已經(jīng)過期；儲(chǔ)藏到第13天時(shí)，發(fā)酵時(shí)間為60 h的豬肉干長了致病菌金黃色葡萄球菌，被淘汰，說明其貨架期為10 d，較未發(fā)酵豬肉干貨架期(2 d)延長了8 d，是發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中貨架期最長的。因此，確定60 h為嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間，主要原因可能是在豬肉進(jìn)行發(fā)酵的過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，嗜酸乳桿菌跨過生長和繁殖階段，進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵，同時(shí)產(chǎn)生谷氨酸和甘氨酸等風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)酵過程中酸類物質(zhì)積累，腐敗菌生理活動(dòng)得到基本抑制，所以其貨架期有所延長。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響

表4 不同發(fā)酵溫度下豬肉干的微生物檢測(cè)結(jié)果

由表4可知，將發(fā)酵豬肉干儲(chǔ)藏7 d后，發(fā)酵溫度為20，25，30 ℃的發(fā)酵豬肉干都檢測(cè)出了致病菌金黃色葡萄球菌，因此被淘汰。發(fā)酵溫度為35 ℃的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏7 d時(shí)大腸菌群為3.1×103CFU/g，超過了大腸桿菌上限值102CFU/g，超標(biāo)，被淘汰。發(fā)酵溫度為40 ℃的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏10 d時(shí)，有3個(gè)樣品菌落總數(shù)在104～105CFU/g之間，說明在該發(fā)酵時(shí)間下的豬肉干貨架期為7 d，是發(fā)酵溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中貨架期最長的。因此，確定40 ℃為嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的最優(yōu)發(fā)酵溫度。相比于未發(fā)酵的豬肉干(2 d)，貨架期延長了5 d，原因可能是在此發(fā)酵溫度下，促進(jìn)了嗜酸乳桿菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高了微生物體內(nèi)酶促反應(yīng)的速度[21]，蛋白質(zhì)和脂肪等在組織蛋白酶和脂肪酶的作用下分解為各種有機(jī)酸(游離氨基酸和乳酸等)，使整個(gè)發(fā)酵豬肉干呈現(xiàn)酸性環(huán)境，腐敗細(xì)菌得到基本抑制，所以發(fā)酵豬肉干的貨架期有所延長。

2.1.4 烘烤時(shí)間對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響

表5 不同烘烤時(shí)間下豬肉干的微生物檢測(cè)結(jié)果

由表5可知，儲(chǔ)藏到第7天時(shí)，烘烤時(shí)間為70 min和75 min的發(fā)酵豬肉干都檢測(cè)出了致病菌金黃色葡萄球菌；烘烤時(shí)間為85 min的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏7 d時(shí)微生物菌落總數(shù)最高，為1.76×105CFU/g，超過了菌落總數(shù)上限值105CFU/g，以上均不符合國家標(biāo)準(zhǔn)，被淘汰。烘烤時(shí)間為80 min的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏13 d時(shí)微生物菌落總數(shù)最高，為1.25×105CFU/g，超過了菌落總數(shù)上限值105CFU/g，而且長出了致病菌金黃色葡萄球菌，說明該烘烤時(shí)間下的豬肉干貨架期為10 d，是烘烤時(shí)間優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中貨架期最長的。因此，確定80 min(烘烤溫度為95 ℃)為嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的最優(yōu)烘烤時(shí)間，相比于未發(fā)酵的豬肉干(2 d)，貨架期延長了8 d。烘烤時(shí)間為80 min的豬肉干貨架期有所延長，原因可能是隨著烘烤時(shí)間的延長，肉干的水分活度(Aw)有所下降，當(dāng)Aw低于0.9時(shí)，細(xì)菌幾乎不能生長，Aw的減少降低了微生物生長速率，延長了微生物對(duì)數(shù)生長期，此外還對(duì)微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)生負(fù)作用，引起了代謝途徑和細(xì)胞成分的變化[22]，所以延長了發(fā)酵豬肉干的貨架期。

2.2 烘烤溫度對(duì)各指標(biāo)的影響

2.2.1 含水率的測(cè)定

為了對(duì)嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的烘烤溫度進(jìn)行優(yōu)化，需要找到不同烘烤溫度下含水率小于且最接近20%(按照國家標(biāo)準(zhǔn)，肉干含水率不超過20%)的烘烤時(shí)間，這樣既能達(dá)到國家要求，又能使豬肉干具有較好口感，不同烘烤條件的發(fā)酵豬肉干含水率見圖1。

圖1 不同烘烤條件下發(fā)酵豬肉干的含水率

由圖1可知，當(dāng)烘烤溫度為75 ℃時(shí)，含水率小于且最接近20%(按照國家標(biāo)準(zhǔn)，肉干含水率不超過20%)的烘烤時(shí)間為125 min，此時(shí)含水率為18.86%。當(dāng)烘烤溫度為85 ℃時(shí)，含水率小于且最接近20%的烘烤時(shí)間為100 min，此時(shí)含水率為19.35%。當(dāng)烘烤溫度為95 ℃時(shí)，含水率小于且最接近20%的烘烤時(shí)間為75 min，此時(shí)含水率為18.20%。當(dāng)烘烤溫度為105 ℃時(shí)，含水率小于且最接近20%的烘烤時(shí)間為65 min，此時(shí)含水率為19.78%。

2.2.2 烘烤溫度對(duì)發(fā)酵豬肉干貨架期的影響

表6 不同烘烤溫度下豬肉干的微生物檢測(cè)結(jié)果

由表6可知，儲(chǔ)藏7 d時(shí)，烘烤溫度為75，95 ℃的發(fā)酵豬肉干都長出了致病菌金黃色葡萄球菌；烘烤溫度為85 ℃的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏10 d時(shí)5個(gè)樣品的菌落總數(shù)在104～105CFU/g之間，以上均不符合國家標(biāo)準(zhǔn)，被淘汰。烘烤溫度為105 ℃的發(fā)酵豬肉干在儲(chǔ)藏13 d時(shí)微生物菌落總數(shù)最高，為2.53×105CFU/g，超過了菌落總數(shù)上限值105CFU/g，說明該烘烤溫度下的豬肉干貨架期為10 d，是烘烤溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中貨架期最長的。因此，確定105 ℃(烘烤時(shí)間為65 min)為嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的最優(yōu)烘烤溫度。相較于未發(fā)酵的豬肉干(2 d)，發(fā)酵豬肉干貨架期延長了8 d，主要原因是該烘烤溫度下制成的發(fā)酵豬肉干的水分含量低，游離水較少，抑制了部分微生物(包括細(xì)菌和霉菌等)的生長，減少了肌肉組織的腐壞和脂肪的氧化與酸敗[23]，因此嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干的貨架期得到延長。

由表5、圖1和表6可知，經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，烘烤溫度為95 ℃、烘烤時(shí)間為80 min的發(fā)酵豬肉干貨架期與烘烤溫度為105 ℃、烘烤時(shí)間為65 min的發(fā)酵豬肉干貨架期一致，但綜合含水率來看，烘烤溫度為105 ℃、烘烤時(shí)間為65 min的發(fā)酵豬肉干口感更好，所以此工藝條件更優(yōu)。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)在30 ℃儲(chǔ)藏下進(jìn)行，此溫度下大部分微生物生長迅速，食品的保質(zhì)期受溫度的影響較大，溫度的升高或降低都會(huì)引起化學(xué)反應(yīng)速率變化。本實(shí)驗(yàn)相當(dāng)于加速了發(fā)酵豬肉干腐敗的進(jìn)程，而一般的肉干的貯藏溫度為20 ℃左右，相當(dāng)于貯藏溫度提高了10 ℃，類似于進(jìn)行了一次破壞性實(shí)驗(yàn)，所以嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干在室溫下的貨架期將會(huì)更長。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在不同的接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、烘烤溫度、烘烤時(shí)間條件下，用嗜酸乳桿菌對(duì)豬肉發(fā)酵制成豬肉干，以發(fā)酵豬肉干微生物指標(biāo)為檢測(cè)對(duì)象，確定出嗜酸乳桿菌發(fā)酵豬肉干儲(chǔ)藏時(shí)間最長的工藝條件為：接種量1%、發(fā)酵時(shí)間60 h、發(fā)酵溫度40 ℃、烘烤時(shí)間65 min、烘烤溫度105 ℃。整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中，發(fā)酵豬肉干并未添加任何防腐劑，不僅保障了發(fā)酵豬肉干的營養(yǎng)價(jià)值和安全性，一定程度上也為廠家出品新產(chǎn)品提供了廣闊的市場(chǎng)前景和生產(chǎn)依據(jù)。