史 瑩，王 丹，姜朋麗，萬曉雨，劉 斌

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 乳腺外科，吉林 長春130041)

三陰乳腺癌 (Triple Negative Breast Cancer,TNBC) 為雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)三者蛋白表達(dá)均陰性的乳腺癌，占乳腺癌總數(shù)的 15%，具有高侵襲性和易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的特點(diǎn)[1]。由于 TNBC 目前無有效的放療、內(nèi)分泌及針對HER-2的分子靶向治療，使得尋找包括中藥提取物在內(nèi)的新的干預(yù)措施顯得至關(guān)重要。葫蘆素B(Cucurbitacin B)是一種高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，存在于葫蘆科植物及其他科屬多種植物中。最新研究發(fā)現(xiàn)低濃度的葫蘆素 B 可以抑制肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)展[2，3]，但關(guān)于葫蘆素B對TNBC 的作用及機(jī)理仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)體外研究葫蘆素B對TNBC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為TNBC臨床治療中葫蘆素 B 的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料三陰乳腺癌細(xì)胞株HCC1806購于中科院上海細(xì)胞所；葫蘆素B購于南京景竹生物科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基和FBS胎牛血清購于美國Gibco公司；胰蛋白酶溶液、MTT和DMSO試劑購于美國Amresco公司；BCA 蛋白含量檢測試劑盒和Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物公司；β-catenin、 Gsk3β、 CyclinD1、 P53、 Caspase-3 和β-actin一抗購于美國Abcam公司；HRP 標(biāo)記的二抗購于武漢博士德生物工程有限公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和Hoechst33258染色液試劑盒購于海門市碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HCC1806細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素)，在37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)80%-90%，棄除舊培養(yǎng)基，加入 0.25% 胰蛋白酶溶液消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)將HCC1806 細(xì)胞接種于96孔板(500個/孔)，加入含不同濃度的葫蘆素B，根據(jù)濃度不同分為3組(濃度分別為0.5，2.5和12.5 μmol/L)，同時設(shè)空白對照組，每組設(shè) 5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng) 48 h后每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO，低速搖床 30 min。酶標(biāo)儀 490 nm 波長下檢測每孔吸光度OD值，計算細(xì)胞增殖抑制率，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率=[1- 實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD 值]×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)將HCC1806細(xì)胞接種于6孔板(5×103個/孔)，分別加入不同濃度的葫蘆素 B，根據(jù)濃度不同分為3組(濃度分別為 0.5，2.5和12.5 μmol/L)，同時設(shè)空白對照組，常規(guī)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，Annexin V和PI雙染料孵育后Guava easy Cyte5微流式細(xì)胞分析儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5 Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)將HCC1806細(xì)胞接種于6孔板(5×103個/孔)，分別加入3組不同濃度的葫蘆素B(濃度分別為0.5，2.5和12.5 μmol/L)，同時設(shè)空白對照組，常規(guī)培養(yǎng) 48 h后加入10%甲醛，固定20 min后加入Hoechst33258染色液，用熒光猝滅液封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)。

1.6 Western blot檢測使用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液沸水浴5 min。12% SDS-PAGE 電泳后 200 mA 電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，4℃ 下 BSA 封閉過夜，室溫 TBST 洗滌后，β-catenin、Gsk3β、CyclinD1、P53、Caspase-3和β-actin一抗孵育2 h，繼續(xù)洗滌后 HRP 標(biāo)記的二抗孵育2 h，ECL 顯色。

2 結(jié)果

2.1 葫蘆素B對HCC1806細(xì)胞增殖的影響MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3組不同濃度的葫蘆素B(0.5、2.5、12.5 μmol/L) 對HCC1806細(xì)胞的增殖抑制率分別為(29.8±3.5)%、(41.7±1.6)%、(57.8±6.6)%。統(tǒng)計分析顯示：不同濃度用藥組之間及各用藥組與對照組之間比較均具有差異統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：葫蘆素B對HCC1806細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，同時具有濃度依賴性。

2.2 葫蘆素B對HCC1806 細(xì)胞凋亡的影響采用Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果如圖1所示，空白對照組(0 μmol/L)及葫蘆素 B 0.5 μmol/L組、2.5 μmol/L組、12.5 μmol/L組細(xì)胞凋亡率分別為(5.1±0.6)%、(14.9±2.4)%、(31.2±2.8)%和(41.1±4.0)%。結(jié)果顯示：HCC1806 細(xì)胞的凋亡率隨著葫蘆素 B 藥物濃度增加而增加。統(tǒng)計分析顯示：與空白對照組比較，葫蘆素 B 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明：葫蘆素B具有促HCC1806細(xì)胞凋亡的作用。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測葫蘆素B對HCC1806細(xì)胞凋亡的影響

2.3 葫蘆素B對HCC1806細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響Hoechst33258染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，在熒光顯微鏡下，空白對照組細(xì)胞核被Hoechst染色呈現(xiàn)較均勻的藍(lán)色，而在葫蘆素B處理后HCC1806 細(xì)胞核可出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)的改變，即濃染顆粒狀熒光、碎片狀熒光和不規(guī)則橢圓形熒光的出現(xiàn)，程度隨著葫蘆素B濃度的提高而增加(P<0.05)。

圖2 Hoechst33258染色檢測葫蘆素B對HCC1806細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

2.4 葫蘆素B對Wnt信號通路及下游關(guān)鍵蛋白的影響Western blot結(jié)果如圖3所示，葫蘆素 B 處理后HCC1806 細(xì)胞較空白對照組，β-catenin 和 CyclinD1 蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Gsk3β、 P53和Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而葫蘆素B 0.5 μmol/L組、2.5 μmol/L組、12.5 μmol/L組3組組間比較，β-catenin、 Gsk3β、 CyclinD1、P53 和 Caspase-3 蛋白表達(dá)量的變化出現(xiàn)濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測葫蘆素B對Wnt信號通路及下游關(guān)鍵蛋白的影響

3 討論

乳腺癌是女性最常見且高度異質(zhì)性的腫瘤，在組織學(xué)形態(tài)、免疫學(xué)表型以及治療效果上具有很大的差異性，使得患者預(yù)后較差[4,5]。本研究發(fā)現(xiàn)三陰乳腺癌細(xì)胞株 HCC1806 經(jīng)過低濃度葫蘆素B處理后，細(xì)胞增殖就受到了明顯抑制，而凋亡能力顯著提升，隨著葫蘆素B 濃度的增加，也對HCC1806 細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為抑制能力不斷增加。本研究初步結(jié)果證明：低濃度葫蘆素B可顯著抑制三陰乳腺癌細(xì)胞株HCC1806的惡性生物學(xué)行為。

以往研究證實(shí)在乳腺癌發(fā)病調(diào)控機(jī)制中，Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮著重要的作用。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路中Wnt分泌蛋白通過跨膜受體蛋白和Dsh/Dvl松散蛋白將信號傳至Gsk3β，Gsk3β磷酸化后導(dǎo)致“APC-Axin-Gsk3β復(fù)合物”無法形成，阻斷了β-catenin 蛋白的降解，β-catenin 蛋白胞質(zhì)內(nèi)聚集并進(jìn)入核內(nèi)，與TCF/LEF結(jié)合后可調(diào)控下游靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用[6]。Shuang 等研究發(fā)現(xiàn)β-catenin與TCF/LEF結(jié)合形成復(fù)合物后可作用于 CyclinD1啟動子導(dǎo)致CyclinD1表達(dá)上調(diào)，CyclinD1作為細(xì)胞周期基因，其主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]，同時復(fù)合物亦可活化Caspase 家族，其中Caspase-3活化為細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡的重要標(biāo)記，Caspase-3活化水平的升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。

本實(shí)驗(yàn)對葫蘆素B抑制三陰乳腺癌細(xì)胞株HCC1806的增殖促進(jìn)其凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)葫蘆素B處理HCC1806細(xì)胞后，細(xì)胞中β-catenin和CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著降低，而Gsk3β、 P53和Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：葫蘆素B可抑制Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)，并影響其下游的關(guān)鍵蛋白CyclinD1、P53和Caspase-3的表達(dá)抑制三陰乳腺癌細(xì)胞株HCC1806 細(xì)胞的生長并促進(jìn)其凋亡。