陳寧軍，劉志剛，趙 軍，李 劍

(1.西安醫(yī)學院附屬寶雞醫(yī)院 神經(jīng)外科，陜西 寶雞721006；2.陜西省第四人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安710043；3.江油市第二人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，四川 江油621701；4.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院西京醫(yī)院 神經(jīng)外科，陜西 西安710032)

膠質瘤最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占所有腦惡性腫瘤的50%-60%[1]。根據(jù)腫瘤的大小、類型、分級、部位以及患者年齡和整體健康狀況，臨床主要采用手術切除后放療、化療、中醫(yī)治療、基因治療等治療手段[2]。然而由于其放化療抗性的出現(xiàn)，膠質瘤患者的中位生存期不足12個月[3]。因此，闡明膠質瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制開發(fā)有效的膠質瘤診療方法對改善膠質瘤治療現(xiàn)狀意義重大。研究顯示長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)通過調控轉錄、轉錄后加工、基因組印記、蛋白質功能在細胞生長、腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用[4]。LINC00665是近年來發(fā)現(xiàn)的基因間lncRNA，研究顯示LINC00665高表達與肝癌患者的腫瘤分級、分期以及總生存期明顯相關，參與對肝癌細胞細胞周期的調控[5]。在胃癌中LINC00665也呈高表達，抑制LINC00665顯著降低胃癌細胞的活力和體外侵襲能力[6]。然而LINC00665在膠質瘤細胞中的作用并未闡明。miR-761在神經(jīng)膠質瘤組織中表達下調，上調miR-761表達可抑制膠質瘤細胞的增殖和遷移[7]。生物信息學分析顯示miR-761是LINC00665的潛在靶基因，但LINC00665能否靶向miR-761參與膠質瘤進展尚未可知。本實驗旨在揭示LINC00665在膠質瘤細胞中的表達以及對膠質瘤細胞增殖、細胞周期分布和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人膠質瘤細胞系A172、U-251MG、SHG139以及人腦正常膠質細胞HEB購于中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM-EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司；TRIzol試劑、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購于北京索萊寶公司；si-con、si-LINC00665、miR-con、miR-761、anti-miR-con、anti-miR-761、野生型熒光素酶報告基因載體(WT-LINC00665)、突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-LINC00665)以及PCR引物由上海吉凱基因化學技術有限公司提供；細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天公司；兔源Ki-67、兔源細胞周期素D1(CyclinD1)、兔源Cleaved caspase-3、兔源β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、兔源c-myc抗體、鼠源β-actin抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購于美國Abcam公司。

1.2 實驗分組

人膠質瘤細胞系A172以及人腦正常膠質細胞HEB采用DMEM培養(yǎng)基，SHG139細胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基、U-251MG細胞采用MEM-EBSS培養(yǎng)基，于37℃、含5% CO2、相對濕度59%的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗。每1-2天更換一次細胞培養(yǎng)液，當細胞鋪滿瓶底的80%時進行細胞傳代。取對數(shù)期細胞A172細胞進行后續(xù)實驗。將A172細胞按照5×104cells/孔接種到6孔板，代細胞融合度約為60%時利用脂質體LipofectamineTM2000進行細胞轉染，將A172細胞分為si-con組、si-LINC00665組、miR-con組、miR-761組，轉染48 h，檢測轉染合格后進行后續(xù)實驗分析。正常培養(yǎng)的A172細胞記為空白對照(Blank)組。為驗證LINC00665是通過調控miR-761進而影響A172細胞的增殖、凋亡以及細胞周期分布，將A172細胞分為si-LINC00665+ anti-miR-con組、si-LINC00665+anti-miR-761組、轉染48 h，進行后續(xù)實驗分析。

1.3 RT-qPCR

采用TRIzol試劑提取細胞樣本總RNA，以提取的總RNA為模板，逆轉錄為cDNA。按照RT-qPCR試劑盒SYBR Green法步驟進行擴增，擴增40個循環(huán)周期。分別以β-actin和U6為內參照，按照2-ΔΔCt公式計算LINC00665和miR-761的相對表達量。引物序列如下。LINC00665上游引物5′-AGCACCCCTAGTGTCAGTCA-3′，下游引物5′-TGGTCTCTAGGGAGGCAGAA-3′；β-actin上游引物5′-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3′，下游引物5′-CGATGCCGTGCTCGATGGGG-3；miR-761上游引物5′-ACAGCAGGCACAGAC-3′，下游引物5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

轉染后，將細胞按照3×103cells/孔接種到96孔板，37℃、含5% CO2、培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h，在酶標儀450 nm波長處檢測各孔的吸光度值。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期的分布

細胞轉染48 h時胰酶消化為單細胞懸液，預冷的PB清洗細胞2次，重懸細胞后，4 ℃固定過夜，碘化丙啶染色后，于流式細胞儀檢測細胞周期的分布。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞轉染48 h時胰酶消化為單細胞懸液，預冷的PB清洗細胞2次，取適量結合緩沖液重懸細胞于流式管內，分別加入膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素和碘化丙啶進行染色，避光孵育15 min后，于流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western Blot檢測Ki-67、CyclinD1、Cleaved caspase-3、β-catenin和c-myc蛋白的表達水平

細胞轉染48 h時，收集各組細胞，RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白。BCA法測定各組樣本蛋白含量，調整蛋白濃度至3 mg/mL后沸水浴5 min變性細胞蛋白，冷卻至室溫后-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg細胞蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白。利用常規(guī)濕法轉膜裝置將細胞蛋白轉移至硝酸纖維素膜，放于5%的脫脂牛奶中室溫封閉2 h，TBST洗膜3 min，將膜置于已稀釋的Ⅰ抗溶液中室溫條件孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，將膜置于已稀釋的Ⅱ抗溶液中室溫條件孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，加入化學發(fā)光顯色試劑顯色，以β-actin為內參，利用Quantity One 4.40軟件分析Ki-67、CyclinD1、Cleaved caspase-3、β-catenin和c-myc蛋白的表達水平。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

采用生物信息學分析工具進行靶基因預測發(fā)現(xiàn)LINC00665和miR-761之間存在部分連續(xù)互補的核苷酸序列，推測miR-761是LINC00665的潛在靶基因。采用脂質體轉染法將miR-761 mimics、miR-NC分別與WT-LINC00665或MUT-LINC00665共轉染至SW620細胞，轉染48 h，采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測各組SW620細胞的熒光素酶活性。同時將si-con、si-LINC00665、pcDNA、pcDNA -LINC00665分別轉染至A172細胞，轉染48 h，按照上述RT-qPCR檢測步驟測定miR-761的表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 LINC00665和miR-761在人腦正常膠質細胞和膠質瘤細胞中的表達

見表1，與人腦正常膠質細胞HEB比較，膠質瘤細胞U-251MG、A172、SHG139中LINC00665的表達水平顯著升高，miR-761的表達水平顯著降低(P<0.05)。

表1 人腦正常膠質細胞和膠質瘤細胞中LINC00665和miR-761的表達

2.2 沉默LINC00665抑制膠質瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯

見圖1和表2，與si-con組比較，si-LINC00665組A172細胞LINC00665的表達水平顯著降低，Ki-67和CyclinD1蛋白的表達水平顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白的表達顯著升高，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，G0-G1期細胞數(shù)顯著升高，S期細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測膠質瘤細胞Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達及流式細胞術檢測膠質瘤細胞凋亡

表2 沉默LINC00665對膠質瘤細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期以及Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

2.3 LINC00665靶向miR-761調控其表達

采用starbase進行靶基因預測發(fā)現(xiàn)LINC00665與miR-761之間存在連續(xù)互補的核苷酸序列，見圖2。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-761 mimics和WT- LINC00665共轉染組A172細胞的熒光素酶活性較miR-con和WT- LINC00665共轉染組顯著降低(P<0.05)；miR-761 mimics和MUT- LINC00665共轉染組A172細胞的熒光素酶活性較miR-con和MUT- LINC00665共轉染組無明顯變化，見表3。RT-qPCR顯示下調LINC00665表達后A172細胞miR-761的表達水平顯著升高；上調LINC00665表達后A172細胞miR-761的表達水平顯著降低，見表4。

圖2 LINC00665與miR-761互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 LINC00665調控miR-761的表達

2.4 過表達miR-761抑制膠質瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯

見圖3和表5，與miR-con組比較，miR-con組A172細胞miR-761的表達水平顯著升高，Ki-67和CyclinD1蛋白的表達水平顯著降低，Cleaved caspase-3蛋白的表達顯著升高，細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著升高，G0-G1期細胞數(shù)顯著升高，S期細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。

圖3 Western blot檢測膠質瘤細胞Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達及流式細胞術檢測膠質瘤細胞凋亡

表5 過表達miR-761對膠質瘤細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期以及Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

2.5 抑制miR-761部分逆轉沉默LINC00665對膠質瘤細胞增殖、凋亡以及細胞周期分布的影響

見圖4和表6，與si-LINC00665+anti-miR-con組比較，si-LINC00665+anti-miR-761組A172細胞miR-761的表達水平顯著降低，Ki-67和CyclinD1蛋白的表達水平顯著升高，Cleaved caspase-3蛋白的表達顯著降低，細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，G0-G1期細胞數(shù)顯著降低，S期細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)。

圖4 Western blot檢測膠質瘤細胞Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達及流式細胞術檢測膠質瘤細胞凋亡

表6 轉染anti-miR-761和si-LINC00665對膠質瘤細胞增殖、細胞凋亡和細胞周期以及Ki-67、CyclinD1和Cleaved caspase-3蛋白表達的影響

2.6 LINC00665調控miR-761影響膠質瘤細胞Wnt/β-catenin信號通路

見圖4和表7，與si-con組比較，si-LINC00665組A172細胞β-catenin和c-myc的表達水平顯著降低；與si-LINC00665+anti-miR-con組比較，si-LINC00665+anti-miR-761組A172細胞β-catenin和c-myc的表達水平顯著升高(P<0.05)。

圖4 Western blot檢測膠質瘤細胞β-catenin和c-myc蛋白表達

表7 轉染anti-miR-761和si-LINC00665對膠質瘤細胞β-catenin和c-myc蛋白表達的影響

3 討論

lncRNA作為活躍的生物分子，在包括膠質瘤在內的多種腫瘤中發(fā)揮重要調控作用。因此，闡明lncRNA在膠質瘤進展中的作用有助于開發(fā)有效的膠質瘤診療方法。

LINC00665在肺腺癌中顯著上調，其高表達在體外和體內均可增強癌細胞的增殖和轉移，是肺腺癌不良預后的獨立預測因子[8]。LINC00665在肝癌中表達上調，LINC00665高表達與肝癌患者生存期較短顯著相關，沉默LINC00665降低肝癌細胞活力并誘導凋亡和自噬[9]。此外，沉默LINC00665還可抑制非小細胞肺癌細胞增殖和誘導細胞凋亡，提高對吉非替尼的敏感性[10]。本研究顯示3種膠質瘤細胞中LINC00665的表達水平顯著升高，沉默LINC00665顯著降低A172細胞活力，引起細胞周期G0-G1期阻滯，促進細胞凋亡，與上述LINC00665的致癌作用一致。細胞增殖失控和凋亡異常是惡性腫瘤的重要特征，檢測增殖、凋亡相關蛋白的表達發(fā)現(xiàn)促增殖蛋白Ki-67的表達顯著降低，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達顯著降低。CyclinD1是推動細胞周期從G1期向S期轉換的關鍵因子，其過度表達導致膠質瘤細胞增殖失控，促進膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展[11]。本研究顯示沉默LINC00665后A172細胞CyclinD1的表達顯著降低。提示LINC00665在膠質瘤進展中發(fā)揮重要作用，有望成為膠質瘤治療的潛在靶點。

既往研究表明miR-761在膠質瘤[7]、結直腸癌[12]中發(fā)揮抑癌基因作用，本研究顯示3種膠質瘤miR-761的表達水平顯著降低，與LINC00665的表達呈負相關關系。進一步研究顯示LINC00665與miR-761之間存在相互作用，且LINC00665靶向負調控miR-761表達。過表達LINC00665顯著降低A172細胞活力，引起細胞周期G0-G1期阻滯，促進細胞凋亡。然而，在肝癌[13]和非小細胞肺癌[14]中miR-761發(fā)揮癌基因作用，LINC00665高表達促進腫瘤的生長和轉移。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-761部分逆轉沉默LINC00665對膠質瘤細胞增殖、凋亡以及細胞周期分布的影響。Wnt/β-catenin途徑是一個高度保守的信號通路，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關重要，其改變與癌癥的發(fā)生密不可分[15]。在膠質瘤細胞中，抑制Wnt/β-catenin途徑可影響細胞周期，抑制腫瘤細胞的增殖和存活[16]。在胃癌細胞中沉默LINC00665通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌進展[17]。本研究顯示沉默LINC00665后A172細胞中Wnt/β-catenin通路活化受到抑制，而抑制miR-761部分逆轉沉默LINC00665對Wnt/β-catenin信號通路的影響。提示LINC00665靶向miR-761調控Wnt/β-catenin信號通路影響膠質瘤的增殖、凋亡和細胞周期分布。

綜上所述，LINC00665在膠質瘤中表達上調，miR-761表達下調。沉默LINC00665通過上調miR-761抑制Wnt/β-catenin信號通路活化進而引起膠質瘤細胞G0-G1期阻滯、抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。因此，LINC00665/miR-761分子軸可以作為膠質瘤治療的潛在靶點。