陳佳琦，孫伯堯，何成彥，岳新顏，李洪軍*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，約90%發(fā)生在腎實(shí)質(zhì)[1]，發(fā)達(dá)國家和男性發(fā)病率較高，其原因尚未明確[2]。盡管腎癌較肺癌、結(jié)直腸癌等疾病發(fā)病率低，但在泌尿生殖系統(tǒng)癌癥中死亡率最高[1]，因此，早期診斷和篩查成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)之一，包括尿液檢查、超聲、腫瘤標(biāo)志物等[3]，由于假陰性、假陽性和過度診斷的發(fā)生，使得腎癌的防治工作充滿挑戰(zhàn)。本次實(shí)驗(yàn)旨在探究HIST1H3B在腎癌組織中的表達(dá)及臨床意義，為腎癌的診斷提供可能的、新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本實(shí)驗(yàn)樣本取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2018年1月到2018年12月經(jīng)病理學(xué)檢查并診斷為腎透明細(xì)胞癌的患者共計18例，采集標(biāo)準(zhǔn)為：腫瘤TNM分期為Ⅲ期，同時未經(jīng)化療、放療或生物治療等任何干預(yù)治療，并排除已發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的新鮮腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本，同時采集癌旁標(biāo)本。將符合采集標(biāo)準(zhǔn)的樣本徹底使用生理鹽水沖洗后進(jìn)行液氮冷凍，置于-80℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1提取與測定樣本總蛋白 取出冰凍保存的樣本放入PBS中清洗，并在液氮中充分研磨，完成后在已成粉末的樣本中加入適量RIPA裂解緩沖液，室溫置于冰上充分震蕩混勻，隨后加入適量RNA酶和DNA酶以去除樣本中游離的RNA和DNA，再以12 000 rmp、4℃、15 min的設(shè)定進(jìn)行離心，取得的上清液即為總蛋白。提取總蛋白后進(jìn)行總蛋白的測定，該過程需采用BCA蛋白定量試劑盒測定該樣本總蛋白在562 nm波長處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣本蛋白濃度。

1.2.2制備蛋白水解多肽混合物 取出妥善保存的總蛋白樣本，用5倍體積的50 mmol/LNH4HCO3溶液進(jìn)行稀釋，隨后加入適量1 mol/L二硫代蘇糖醇(DTT)至溶液濃度為20 mmol/L，置于56℃避光條件下反應(yīng)1 h，再冷卻至室溫并加入適量1 mol/L的碘代乙酰胺(IAM)至溶液濃度為50 mmol/L，在室溫避光條件下反應(yīng)30 min。完成后在該反應(yīng)體系中加入蛋白：胰酶比例為50∶1的測序級胰酶，置于37℃的水浴箱中12 h，所得產(chǎn)物分裝后置于-80℃冰箱保存。

1.2.3二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 取出上述步驟中分裝凍存的樣品，加入0.1%FA溶液進(jìn)行溶解，分裝樣品各取50 μg用于色譜上樣，再使用LTQ XL離子肼質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.2.4免疫印跡試驗(yàn) 用免疫印跡試驗(yàn)分別檢測目標(biāo)蛋白HIST1H3B在腎癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況，以驗(yàn)證二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的分析結(jié)果。

1.2.5儀器與試劑 PBS、苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解緩沖液、RNA酶、DNA酶、離心機(jī)、BCA蛋白定量試劑盒、NH4HCO3溶液、DTT、IAM、測序級胰酶、Agilent 1200高效液相色譜儀、伯樂垂直電泳儀、LTQ XL離子肼質(zhì)譜儀、HIST1H3B單克隆抗體。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析腎癌組織和癌旁組織的結(jié)果

本次試驗(yàn)中，癌組織樣本和癌旁組織樣本中同一蛋白的豐度以譜圖數(shù)的差異來衡量，同時滿足兩個樣本中蛋白譜圖數(shù)比值≥1且該對樣本譜圖數(shù)差值≥72的蛋白定義為差異蛋白。按上述定義標(biāo)準(zhǔn)，檢測出包括14個上調(diào)表達(dá)蛋白，7個下調(diào)表達(dá)蛋白，共計21個差異表達(dá)蛋白，見表1，其中目標(biāo)蛋白HIST1H3B為上調(diào)表達(dá)蛋白，HIST1H3B質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

表1 腎癌組織及癌旁組織差異蛋白

圖1 HIST1H3B質(zhì)譜圖結(jié)果

2.2 免疫印跡試驗(yàn)分析HIST1H3B在腎癌和癌旁組織中的表達(dá)結(jié)果

使用免疫印跡試驗(yàn)分析HIST1H3B在腎癌和癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明HIST1H3B在腎癌組織中表達(dá)量高于其配對的癌旁組織，進(jìn)一步驗(yàn)證了LC-MS技術(shù)分析結(jié)果。

圖2 免疫印跡試驗(yàn)分析HIST1H3B在腎癌和癌旁組織中的表達(dá)

3 討論

組蛋白家族主要包括H1、H2B、H3、和H4[4]，共同參與核小體的構(gòu)成[5]。其中組蛋白H3對于維持染色體正常結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義[6]。組蛋白H3主要有H3.1、H3.2、H3.3、著絲粒蛋白-A和睪丸特異性組蛋白H3t等5種變體。組蛋白H3.1沉積在染色質(zhì)中，通常依賴DNA復(fù)制，并發(fā)生在CAF-1分子伴侶介導(dǎo)的過程中[7]。已有研究表明，組蛋白基因在乳腺癌、肝癌中患者中均為高表達(dá)[4，8]，同時組蛋白基因可能會成為檢測乳腺癌、喉癌、宮頸癌患者生存的預(yù)后指標(biāo)[4，9，10]，更有研究表明，組蛋白H3變異體的突變可能是彌漫性橋腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(DIPG)的潛在特異性治療靶標(biāo)[11]，可能為相關(guān)疾病提供新的治療方向。

目前關(guān)于HIST1H3B的研究大部分與共價修飾方面有關(guān)，而關(guān)于組蛋白與癌癥的關(guān)系、組蛋白在癌癥中可能存在的作用等方面的研究較少，有待進(jìn)一步探究。

近年來，我國乃至全球范圍內(nèi)腎癌發(fā)生率呈現(xiàn)出逐年上漲的趨勢[12]，由于早期診斷和篩查的不完善，目前主要依靠影像學(xué)手段明確診斷。已有大量研究證實(shí)，DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA表達(dá)等表觀遺傳性改變在腎癌發(fā)生過程中起重要作用[12]。因此在未來科研工作中探究腎癌相關(guān)基因遺傳學(xué)方面顯得尤為重要。集合管癌(CDC)是一種罕見的腎癌亞型，預(yù)后差，Wach等人提出組蛋白基因HIST1H3B(H3.1)在集合管癌中表達(dá)上調(diào)[13]，這一研究結(jié)果可能為腎癌的早期診斷提供新的思路，但由于臨床數(shù)據(jù)有限及亞型的局限性，不能說明HIST1H3B在其他亞型腎癌中的表達(dá)情況。本研究應(yīng)用二維色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)證明了HIST1H3B在腎癌中的表達(dá)量上調(diào)，且在癌組織中表達(dá)量明顯高于其配對的癌旁組織，不排除HIST1H3B與腎癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但具體機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步研究。