徐 熙，楊喜翠，徐如宏

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 油料研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)機(jī)械技術(shù)推廣總站，貴州 貴陽 550006；3.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

小麥條銹病是一種由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tririci)引起的氣傳性真菌類病害，具有變異程度高，流行程度廣，降低小麥品質(zhì)、產(chǎn)量的特點(diǎn)[1-3]。條銹菌對(duì)低溫適應(yīng)能力較強(qiáng)，不耐高溫。前人研究表明，中國小麥條銹病5大越夏區(qū)為西北、四川西北、華北、云貴、新疆[4]。由于病原菌與寄主具有較高的協(xié)同進(jìn)化能力，小麥品種在生產(chǎn)上使用3-5年便會(huì)喪失抗銹性，因此選育抗病品種是防治小麥條銹病最為安全，經(jīng)濟(jì)，有效的方法[5-6]。在小麥條銹抗病基因研究中，SSR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于檢測，標(biāo)記，定位目的基因。目前已發(fā)現(xiàn)小麥抗條銹基因80多個(gè)，如Yr10，Yr15,Yr17,Yr19等，其中34個(gè)主效抗條銹基因已被正式命名，包括苗期抗病基因，成株期抗病基因，以及部分尚未明確的抗病基因[7]。陳尚安等[8]認(rèn)為大多數(shù)已知小麥抗條銹基因來源于普通小麥，小部分源于小麥近源屬(種)。Yr10源于小麥品種Moro,該抗病基因作為有效抗原在四川、貴州等地廣泛應(yīng)用，貴州高抗條銹小麥品種中，8.3%應(yīng)用此抗源[9]。Yr15源于栽培二粒小麥(T.dicoccoidesG-25)，伍玲等[10]對(duì)96份四川省2004,2005年度在區(qū)試實(shí)驗(yàn)中被鑒定為高抗到免疫的小麥材料進(jìn)行Yr15SSR分析標(biāo)記檢測，結(jié)果表明，11.1%的區(qū)試材料含有Yr15抗性標(biāo)記帶。Yr26來自圓錐小麥(T.turgidumL.)，西南地區(qū)和黃淮地區(qū)尤為依賴，在云貴地區(qū)推廣品種如貴農(nóng)775，貴農(nóng)21，云麥52，川麥47等品種中均進(jìn)行廣泛應(yīng)用[11]，2009年出現(xiàn)的小麥條銹菌新菌系V26對(duì)貴農(nóng)22，含‘Moro’血緣品種，川麥42等小麥品種均具致病性[12]，抗病基因單一布局和病菌群體毒性組成變化的反復(fù)發(fā)生，是小麥條銹病品種選育中的關(guān)鍵問題。

小麥不僅是貴州主要糧食作物之一，而且是唯一的冬季糧食作物，常年面積在45萬hm2左右，僅次于水稻、玉米[12]。貴州省地處云貴高原，夜間冷涼，條銹病生理小種變異速度較快。受冬季溫度偏高、田間濕度大等因素影響，2017年貴州條銹病發(fā)病范圍廣，程度重[13]，對(duì)小麥的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)造成危害。本研究以貴州大學(xué)麥作研究中心選育和引進(jìn)小麥資源為材料，經(jīng)在田間進(jìn)行條銹抗性鑒定，進(jìn)行條銹病相關(guān)的Yr10，Yr15，Yr26抗性基因的分子標(biāo)記檢測，探索和闡明這些材料攜帶的抗性基因，為合理配合抗性品種，有效利用抗病基因和抗病材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥種質(zhì)材料由貴州大學(xué)麥作研究中心、中農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供

小麥種質(zhì)種植于貴州省麥作中心，在自然誘發(fā)條件、條銹病充分發(fā)病后，于2017年4月下旬進(jìn)行田間鑒定，按國家標(biāo)準(zhǔn)《小麥條銹病測報(bào)調(diào)查規(guī)范(GB/T15795-1995)》觀察記錄小麥種質(zhì)對(duì)條銹病的反應(yīng)型，選取29份小麥種質(zhì)作為供試材料，以高感條銹病材料輝縣紅為陰性對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

取6月中旬田間麥苗抗病植株灌漿種子，用天根植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03)進(jìn)行小麥基因組總DNA的提取。

1.2.2 PCR檢測

選取Yr10、Yr15、Yr26，共3個(gè)連鎖分子標(biāo)記對(duì)所測的29份小麥材料進(jìn)行SSR檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，10×buffer(500mmol/LKCL)2μl;25mmol/LMgCl21.6μl；2.5mmol/LdNTP0.4μl;5mmol/Lprimer各1μl;50ng/μl DNA模板2μl；2.5U/μlTagDNA聚合酶0.5μl；ddH2O11.5μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性(95℃ ，5min)，變性(95℃，45s),退火(50～60℃，45s),延伸:(72℃，60s)。反應(yīng)程序?yàn)?5個(gè)循環(huán)；延伸(72℃，10min)。獲取PCR產(chǎn)物后，用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳銀染。

2 結(jié)果與分析

2.1 Yr10分子檢測

邵應(yīng)田等[14]利用AFLP標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在具有Yr10基因的抗病材料中可擴(kuò)增出SC200、SC180兩條帶，SC200為特異帶且與Yr10抗病基因緊密連鎖，SC180則為非特異條帶，在所有供試材料中皆有出現(xiàn)。由表1可知，陰性對(duì)照品種輝縣紅檢測到210和180，29份供試材料中,周麥檢測到180bpt、200bp、210bp顯示條帶，表明周麥中有含Yr10的連鎖標(biāo)記，且可能具有Yr10抗病基因。貴農(nóng)19只檢測到180bp一條帶，貴農(nóng)30，貴農(nóng)18，貴紫1號(hào)等已審定的品種及剩余材料皆檢測180bp和210bp兩條非特異條帶，表明這些材料中不含Yr10的連鎖標(biāo)記，不含Yr10基因。

表1 抗性基因連鎖標(biāo)記和引物序列

圖1 小麥抗條銹病基因Yr10連鎖標(biāo)記SC200的檢測

2.2 Yr15分子檢測

李奇峰等[15-16]通過SSR分子檢測表明,Yr15的引物Xbarc8可擴(kuò)增200bp的抗病標(biāo)記帶。由圖2、表2可知貴農(nóng)19，小黑麥，豐優(yōu)8號(hào)， 13-2-10中檢測出200bp條帶，說明這些材料中含有Yr15連鎖標(biāo)記，可能含有Yr15抗病基因。在貴農(nóng)19，中燕親本中檢測到300bp條帶，,1051,1073，1210，貴農(nóng)30中等材料中皆出現(xiàn)290bp條帶，說明這種材料未含Yr15連鎖標(biāo)記，不含Yr15基因。

圖2 小麥抗條銹病基因Yr15連鎖標(biāo)記Xbarc8的檢測

2.3 Yr26分子檢測

萬江華等[9,17-18]以內(nèi)麥9號(hào)為陽性對(duì)照，以Xgwm11為引物，檢測到長度為215bp及193bp的條帶，本研究標(biāo)為“1”型；陰性對(duì)照品種綿陽26則檢測到長度和225bp和203bp,本研究標(biāo)為“0”型。當(dāng)引物為Xgwm181時(shí)，陽性品種即可檢測出195bp，陰性品種則與綿陽26帶型相同，片段大小為180bp。由圖3A，表2可知1052,1051，中燕親本等18份材料皆檢測出“1”型條帶。 其他材料檢測帶型為“0”,少數(shù)幾個(gè)材料未出現(xiàn)目標(biāo)條帶。以Xgwm181為引物，由圖3B,表2可知，1051，1061，中燕親本，貴紫1號(hào)等13份材料皆檢測除195bp目標(biāo)帶，剩余材料則出現(xiàn)180bp條帶。由圖3，表2可知，1210，小黑麥，石無芒1號(hào)，10無芒4份材料同時(shí)檢測出“1”帶型和195bp標(biāo)記帶，說明這些材料含有Yr26連鎖標(biāo)記，可能含有Yr26抗病基因。

圖3 小麥抗條銹病基因Yr26連鎖標(biāo)記Xgwm11(A),Xbarc181(B)的檢測

表2 29份小麥Yr10、Yr15、Yr26分子檢測及田間鑒定

輝縣紅0000高感中燕親本0001高抗12100011高抗貴紫1號(hào)00-1中抗貴農(nóng)19(無芒)01-1高抗貴農(nóng)300000高感小黑麥0111高抗周麥1010高抗加拿大-10000中抗豐優(yōu)8號(hào)01-0高抗13-2-1001-0高抗貴農(nóng)18選曹7-8-40-00高抗石無芒1號(hào)0011高抗貴農(nóng)10-800-0高抗貴紫4號(hào)0011高抗10無芒0000高抗

3 討論

3.1 抗性標(biāo)記與抗性基因檢測的關(guān)系

貴州作為小麥條銹病越夏區(qū)之一，開展抗病品種的篩選、選育及推廣，在育種過程中聚合抗條銹基因，是保證小麥穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)較為經(jīng)濟(jì)有效的手段。結(jié)合前人研究，SC200緊密連鎖Yr10抗條銹病基因，在 Yr10的檢測中廣泛應(yīng)用[14,16]。試驗(yàn)結(jié)果表明，周麥中可能含有Yr10抗病基因，這與張玉薇[19]的研究結(jié)果相同。29份供試材料中，檢測出180bp非抗性基因標(biāo)記條帶，除貴農(nóng)19外，其他所選試驗(yàn)材料均檢測出210bp條帶，該結(jié)果可能由于大部分供試材料遺傳背景中不含有Moro,田間表現(xiàn)優(yōu)秀或許是由于含有其他抗病基因。自Mcintosh[20]等將Yr15基因定位于1B染色體短臂后，Yr15在四倍體和六倍體小麥中大量應(yīng)用。檢測結(jié)果表明，13.79%的材料可能含有Yr15連鎖標(biāo)記，其他材料則不含Yr15抗病基因。由于Yr15為全生育期抗條銹基因，部分材料雖田間鑒定表現(xiàn)中抗或高抗，但不含Yr15抗病基因,該結(jié)果可能是由于含有其他基因?qū)е驴共”憩F(xiàn)。Yr26基因位于小麥1B染色體上，作為抗源廣泛應(yīng)用于我國主栽品種中。本研究同時(shí)使用Xgwm11和Xbarc181兩個(gè)位于主基因兩側(cè)的連鎖標(biāo)記檢測Yr26基因，以提高分子檢測的準(zhǔn)確性[6]。本次檢測中55.17%的材料可能含有Yr26,說明Yr26作為條銹抗源仍然廣泛使用于生產(chǎn)品種中。

3.2 小麥種質(zhì)中Yr10、Yr15、Yr2抗病基因分布及利用

檢測結(jié)果表明，供試的29份小麥種質(zhì)材料中，可能含有Yr10、Yr15、Yr26，各基因分別占總材料的3.44%，13.79%，55.17%，周麥同時(shí)含Yr10和Yr26，貴農(nóng)19(無芒)和小黑麥兩份材料同時(shí)含有Yr15和Yr26，超過一半的供試材料含有Yr26基因。王鳳樂[21]研究發(fā)現(xiàn)，Yr10對(duì)優(yōu)勢生理小種條中30和條中31表現(xiàn)免疫，張玉薇對(duì)我國國審小麥品種檢測發(fā)現(xiàn)含Yr10小麥品種主要分布在河南及北方地區(qū)，西南地區(qū)利用較少。本次對(duì)Yr10的檢測結(jié)果與張玉薇研究結(jié)果相同，貴州品系中未發(fā)現(xiàn)含有含有Yr10的品種，攜帶Yr10的周麥屬于河南小麥品種。貴農(nóng)系是攜帶Yr26的代表品種[22]，作為遺傳背景廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)品種中。陳天青等[21]通過對(duì)抗病位點(diǎn)PCoA分析發(fā)現(xiàn)，貴州小麥抗病品系中，絕大多數(shù)含有Yr26基因位點(diǎn)，Yr9則相對(duì)較低。本次檢測印證了陳天青的研究結(jié)果。變異小種V26會(huì)使攜帶Yr26、Yr10的小麥品種抗性喪失，對(duì)Yr9則不會(huì)造成威脅，在今后的育種工作中，應(yīng)注重Yr26與Yr9的聚合，預(yù)防V26在貴州小麥抗病品種中的蔓延。

貴農(nóng)10-8，貴農(nóng)18選曹7-8-4，雖屬貴農(nóng)背景，卻未檢測出Yr26基因，且田間表現(xiàn)良好，可能含有其他抗病基因,應(yīng)加強(qiáng)對(duì)此類品種的培育。張立異等[23-24]研究表明西南冬麥區(qū)小麥品系中有27.1%攜帶1BL/1RS異位系片段，而北方、黃淮冬麥區(qū)小麥品系中1BL/1RS異位系占46%和57%。1BL/1RS異位系不僅對(duì)小麥條銹病抗病性好，而且適應(yīng)性強(qiáng)，在合理利用的同時(shí)減少其對(duì)小麥品質(zhì)的影響，豐富貴州品系抗條銹基因，增加遺傳多樣性。四川發(fā)現(xiàn)的新菌G22-9和G22-14對(duì)Yr10和Yr26具有聯(lián)合毒性[2]，潛在流行小種CH42等對(duì)Yr24/26有致病性。陳天青研究表明，140份西南地區(qū)小麥品種未攜帶Yr15,兩份材料為Yr10+Yr26的雙基因組合，Yr10、Yr15 在西南地區(qū)利用頻率較低。本次檢測中，雙基因組合為Yr10+Yr26(1份)、Yr15+Yr26(2份)，該結(jié)果與陳天青部分結(jié)果一致，此外，貴州品系中Yr15+Yr26雙基因組合的出現(xiàn)說明近年來貴州育種工作者對(duì)Yr15利用的重視。育種工作者應(yīng)謹(jǐn)慎選擇親本，聚合多種抗條銹基因，開發(fā)引進(jìn)抗病基因，對(duì)已培育出的品種加以改良，培育聯(lián)合抗病品種，延緩品種抗性。對(duì)抗條銹病基因進(jìn)行合理布局，預(yù)防抗性喪失，保障小麥生產(chǎn)安全。