廖朝選，錢青青，齊 凱，羅 干，何 季

(1.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014；2.貴州大學 農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025)

大豆在現(xiàn)代社會是不可缺少的作物之一，中國擁有世界上最豐富的大豆資源。大豆不僅是重要的油料作物，還是人類日常生活中植物蛋白的重要來源。[1]此外，大豆還是重要的保健食品和工業(yè)原料。[2]自2004年以來，我國大豆總產(chǎn)量持續(xù)下降，但進口量卻持續(xù)增加，嚴重威脅我國糧油食品安全。[3]目前，我國大豆的種植面積在不斷減少，加上生產(chǎn)技術的落后，導致我國大豆產(chǎn)量的單產(chǎn)、總產(chǎn)都不高，進而嚴重影響豆農(nóng)的經(jīng)濟效益和種豆熱情，生產(chǎn)的惡性循環(huán)與國際大豆的競爭失利使我國的大豆生產(chǎn)陷入危機。[4]有研究表明，土壤有效磷的缺乏是制約大豆單產(chǎn)的主要營養(yǎng)因素。[5-6]而長期大量施用磷肥會導致大多數(shù)農(nóng)田中的磷素含量很高，但大多數(shù)都是不能被植株直接吸收利用的，而能被作物直接吸收利用供其生長發(fā)育的磷素很少，這常被稱之為“遺傳學缺磷”。[7]不同的立地條件、氣候因素和地質背景等導致大豆具有極高的遺傳多樣性。篩選低磷條件下具有較高適應能力的大豆種質資源將極大地促進大豆種質資源創(chuàng)新和高效生產(chǎn)，也是提高作物磷利用率以及大豆產(chǎn)量的關鍵所在。土壤性質對于實現(xiàn)大豆的高效、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義，因此，研究不同品種大豆土壤磷添加與土壤特性之間的關系十分必要。

植物的生長在土壤中不能脫離微生物的作用，尤其是共生微生物和根際微生物。[8]微生物數(shù)量及種群結構在一定程度上受土壤環(huán)境的影響而變化,它可以反映土壤的生物學環(huán)境，能作為土壤肥力的一個指標。[9]土壤酶是土壤組分中最為活躍的有機成分之一，它對土壤環(huán)境變化的響應十分敏感[10]，其活性不僅可以反映土壤微生物活性，還可以表征土壤養(yǎng)分的轉化與運移能力，是評價土壤肥力和表征生態(tài)環(huán)境質量優(yōu)劣的重要參數(shù)之一。[11-13]施肥能有效提高土壤微生物的根際效應，增加土壤中微生物數(shù)量，并能改變土壤酶的活性。[14]但是長期單施和過量施用化肥也會導致土壤有機質含量降低、土壤微生物性狀發(fā)生變化。[15-16]而微生物的分泌物和土壤酶能提高土壤磷的有效性，如微生物和酶具有將土壤中有機磷轉化成可供植物吸收的無機磷的能力，以增加土壤磷的利用效率。[8, 17-18]豆科植物具有固氮能力，但需要磷素為其提供結瘤營養(yǎng)，為了進一步探究施肥與大豆土壤微生物和酶活性之間的關系，本研究以黔豆8號、9號和10號為對象，通過測定施磷肥大豆土壤和不施磷肥大豆土壤微生物的數(shù)量和土壤酶的活性，研究不同品種大豆土壤的微生物數(shù)量與酶活性對施磷肥的響應，從而為大豆種植提出適宜的施肥建議。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗區(qū)位于貴州省銅仁市石阡縣湯山鎮(zhèn)，東經(jīng)108°22′9″～108°22′18″，北緯27°30′2″～27°30′12″，屬喀斯特地貌，山地面積占大多數(shù)，達70%。該區(qū)屬于中亞熱帶季風濕潤氣候，冬無嚴寒夏無酷暑，全年平均氣溫為16 ℃～17 ℃，年降雨量為1050～1150mm。日照充足、暖濕同季、氣候溫和、無霜期長。試驗區(qū)在山腳，其土壤類型為黃壤，呈酸性，其基本理化性質見表1。

表1 研究區(qū)土壤物理化學性質

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設計

以石阡縣湯山鎮(zhèn)的小面積大豆土壤為研究對象。在大田條件下，選擇貴州省黔豆8號、9號和10號為試驗材料，在研究區(qū)進行大田試驗。每公頃施入氮(尿素)50kg，鉀(草木灰)40kg，氮肥和鉀肥作為基肥在種植前施入。試驗采取裂區(qū)區(qū)組設計，磷肥處理為主區(qū)：施磷(每公頃35kg)和不施磷肥(CK)；品種處理為副區(qū)：黔豆8號、9號和10號；每個處理3次重復，每個小區(qū)面積為6m2(2m×3m)，采取穴播方式種植(行距為40cm，株距20cm，每穴2粒)。2018年4月上旬播種，統(tǒng)計田間出苗情況，全生育期內(nèi)雨養(yǎng)處理，手工清除田間雜草。

1.2.2 樣品采集

2018年8月中旬于大豆收獲時取土，每個小區(qū)取對角線上三點，用無菌小鏟子除去表層土，分層取0～20cm、20～40cm土壤樣品，充分混勻后用四分法分出約1kg的土樣，盛入無菌塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點環(huán)境等，將土帶回實驗室。土壤樣品分兩部分：測定酶的土樣在自然條件下風干，揀去植物殘渣和石塊，用研缽研磨制備成2mm和0.25mm兩個粒級的樣品，用自封袋裝好寫上標簽備用；而測微生物的土樣取回后立即放在4℃冰箱中保存待測。

1.2.3 測定方法

土壤微生物數(shù)量采用稀釋涂布平板法測定，采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)細菌，馬丁氏培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)真菌，高氏Ⅰ號培養(yǎng)基平板混菌法培養(yǎng)放線菌。利用苯酚鈉比色法測定脲酶活性，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶酶活性，3，5—二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性，磷酸苯二鈉比色法測定酸性磷酸酶酶活性。[19]

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計與分析，用單因素方差分析(One-Way ANOVA)的方法進行方差分析，用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。顯著性水平設定為α=0.05。采用Excel和Sigmaplot10.0制圖。

2 結果

2.1 施磷肥對土壤微生物數(shù)量的影響

由表2可知，在0～20cm土層中，細菌數(shù)量最多，其次是放線菌，最少為真菌。不施肥條件下，黔豆8號和9號的細菌數(shù)量顯著高于10號(P<0.05)，黔豆8號、9號和10號的真菌和放線菌數(shù)量之間沒有顯著差異(P>0.05)；施磷肥條件下，3個品種大豆的土壤微生物數(shù)量之間同樣沒有顯著差異(P>0.05)。同一個大豆品種，施磷肥與不施磷肥的土壤細菌、真菌、放線菌數(shù)量均有顯著差異(P<0.05)；與不施磷肥相比，黔豆8號的細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加19.6%、30.26%、33.2%；黔豆9號分別增加23.13%、33.84%、37.77%；黔豆10號分別增加37.28%、44.34%、56.97%，黔豆10號的微生物數(shù)量增加最明顯。

表2 磷肥施用對0-20cm土層土壤微生物數(shù)量的影響

由表3可知，在20～40cm土層中，細菌數(shù)量最多，其次是放線菌，最少為真菌。不施肥條件下，黔豆9號的真菌數(shù)量顯著高于8號和10號(P<0.05)，3個品種大豆土壤的細菌和放線菌數(shù)量之間沒有顯著差異(P>0.05)；施磷肥條件下，黔豆9號和10號的細菌數(shù)量顯著高于8號(P<0.05)，黔豆9號的真菌數(shù)量顯著高于8號(P<0.05)，3個品種大豆土壤的放線菌數(shù)量之間沒有顯著差異(P>0.05)。同一個大豆品種，施磷肥與不施磷肥處理土壤細菌、真菌、放線菌數(shù)量均有顯著差異(P<0.05)；與不施磷肥相比，黔豆8號的細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加28.06%、54.59%、52.97%；黔豆9號分別增加33.50%、45.55%、38.64%；黔豆10號分別增加47.64%、61.6%、75.22%，黔豆10號的微生物數(shù)量增加最明顯。

表3 磷肥施用對20-40cm土層土壤微生物數(shù)量的影響

0～20cm層土壤中細菌、放線菌、真菌數(shù)量明顯高于20～40cm層。不施磷肥土壤中黔豆8號0～20cm土層中細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別是20～40cm層的1.46倍、1.44倍、1.39倍；黔豆9號分別為1.34倍、1.37倍、1.14倍；黔豆10號分別為1.08倍、1.34倍、1.46倍。施磷肥土壤中黔豆8號0～20cm土層中細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別是20-40cm層的1.36倍、1.21倍、1.21倍；黔豆9號分別為1.24倍、1.26倍、1.14倍；黔豆10號分別為1.15倍、1.20倍、1.31倍。

2.2 施磷肥對土壤酶活性的影響

2.2.1 施磷肥對大豆土壤酸性磷酸酶活性的影響

土壤磷酸酶是一種常見的水解酶，廣泛分布于生物界，由于土壤酸堿性影響其活性，可將其分為酸性磷酸酶、中性磷酸酶和堿性磷酸酶，本試驗測定土壤為酸性土，酸性磷酸酶活性最強，因此最終選擇測定酸性磷酸酶活性，磷酸酶活性以24h后每克土壤中的酚毫克數(shù)表示。由圖1可知，各處理下，0～20cm土層的酸性磷酸酶活性均高于20～40cm；在0～20cm土層中，不同品種大豆土壤的酸性磷酸酶活性在施磷肥后均有顯著降低(P<0.05)，黔豆8號、9號和10號不施磷肥土壤中的酸性磷酸酶活性比施磷肥條件下分別高62.17%、32.47%和52.97%；20～40cm土層中，黔豆8號、9號土壤的酸性磷酸酶活性在施磷和不施磷間沒有顯著差異(P>0.05)，黔豆10號不施磷條件下的酸性磷酸酶活性顯著高于施磷條件下(P<0.05)，高39.42%。

注：小寫字母不同表示0～20cm土層在0.05水平上差異顯著；大寫字母不同表示20～40cm土層在0.05水平上差異顯著。圖1 磷肥施用對大豆土壤酸性磷酸酶活性的影響

2.2.2 施磷肥對大豆土壤脲酶活性的影響

土壤脲酶是研究較為廣泛深入的一種酶，是尿素胺基水解酶類的統(tǒng)稱，廣泛存在于土壤中。脲酶作用單一，只能水解尿素。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、全氮、有機物質含量及速效磷含量呈正相關。人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。本試驗土壤脲酶活性以24h后每克土壤中NH3～N的毫克數(shù)表示。由圖2可知，各處理下，0～20cm土層的脲酶活性均高于20～40cm。0～20cm土層中，黔豆8號和黔豆9號不施磷肥土壤的脲酶活性顯著高于施磷肥土壤(P<0.05)，分別高30.09%和25.18%。黔豆10號不施磷肥與施磷肥土壤的脲酶活性之間沒有顯著差異(P>0.05)。20～40cm土層中，黔豆8號、黔豆9號和黔豆10號不施磷肥與施磷肥土壤的脲酶活性之間均沒有顯著差異(P>0.05)。

注：小寫字母不同表示0～20cm土層在0.05水平上差異顯著；大寫字母不同表示20～40cm土層在0.05水平上差異顯著。圖2 磷肥施用對大豆土壤脲酶活性的影響

2.2.3 施磷肥對大豆土壤過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶的活性可以表征土壤肥力狀況和生物學活性。根際土壤的過氧化氫酶活性遠較根際外土壤高。有機質含量高的土壤，過氧化氫酶的活性較強。本試驗過氧化氫酶酶活性以20min后的每克土壤的0.1N高錳酸鉀的毫升數(shù)表示。由圖3可知，處理后，0～20cm土層的過氧化氫酶活性高于20～40cm層。在0～20cm土層中，不同品種大豆土壤的過氧化氫酶活性在施磷肥后均有升高，黔豆8號、9號和10號分別升高15.84%、22.31%和33.29%；其中，黔豆8號和黔豆9號施磷肥土壤的過氧化氫酶活性與不施磷肥土壤之間沒有顯著差異(P>0.05)，黔豆10號施磷肥土壤的過氧化氫酶活性與施磷肥土壤之間有顯著差異(P<0.05)。在20～40cm土層中，黔豆8號、黔豆9號和黔豆10號不施磷肥與施磷肥土壤的過氧化氫酶活性之間均沒有顯著差異(P>0.05)。

注：小寫字母不同表示0～20cm土層在0.05水平上差異顯著；大寫字母不同表示20～40cm土層在0.05水平上差異顯著。圖3 磷肥施用對大豆土壤過氧化氫酶活性的影響

2.2.4 施磷肥對大豆土壤蔗糖酶活性的影響

土壤蔗糖酶與土壤中有機質、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強度有關，其與土壤有機質的相關性最大。它能夠表征土壤生物學活性強度，也可以作為評價土壤熟化程度和土壤肥力水平的一個指標。本試驗中蔗糖酶活性以24h后每克土壤中葡萄糖的毫克質量表示。由圖4可知，各處理下，0～20cm土層的過氧化氫酶活性高于20～40cm層。在0～20cm土層中，不同品種大豆土壤的蔗糖酶活性之間差異均達到顯著水平(P<0.05)；其中，施磷肥黔豆8號、黔豆9號黔豆10號的土壤蔗糖酶活性分別比不施磷肥的同品種的土壤蔗糖酶活性高34%、57%、93%。在20～40cm土層中，3個品種大豆土壤施磷肥條件下的蔗糖酶活性均高于不施磷肥土壤，且均達到顯著水平(P<0.05)。

注：小寫字母不同表示0～20cm土層在0.05水平上差異顯著；大寫字母不同表示20～40cm土層在0.05水平上差異顯著。圖4 磷肥施用對大豆土壤蔗糖酶活性的影響

2.3 土壤酶活性與微生物數(shù)量的相關性分析

從表4可知，在0～20cm土層中，細菌和放線菌數(shù)量與過氧化氫酶和蔗糖酶活性呈顯著的正相關關系(P<0.05)，與酸性磷酸酶活性呈顯著的負相關關系(P<0.05)，與脲酶活性相關性較小。真菌數(shù)量與過氧化氫酶活性呈顯著的正相關關系(P<0.05)，與酸性磷酸酶活性呈顯著的負相關關系(P<0.05)，與脲酶及蔗糖酶活性相關性較小。從表5可知，在20～40cm土層中，土壤中的細菌、真菌、放線菌數(shù)量與酸性磷酸酶及蔗糖酶活性顯著相關(P<0.05)，其中與酸性磷酸酶呈顯著正相關關系(P<0.05)，與蔗糖酶活性呈顯著負相關關系(P<0.05)。

表4 0～20cm層微生物數(shù)量與土壤酶活性的相關性

表5 20～40cm層微生物數(shù)量與土壤酶活性的相關性

3 結論與討論

3.1 討論

施肥對土壤中微生物數(shù)量和種類有不同程度影響，而種植不同種類作物其土壤微生物的數(shù)量對施肥的響應也不同。[20-22]本研究以貴州大豆育成品種黔豆8、9和10號為對象，通過對施加磷肥的成熟期大豆土壤與不施加磷肥的成熟期大豆土壤進行微生物數(shù)量的測定，發(fā)現(xiàn)施加磷肥在一定程度上能增加大豆土壤細菌、真菌、放線菌的數(shù)量，這主要是由于施入的磷肥可以促進大豆地上部分的生長，增加了外源碳的輸入，以此增加了土壤微生物數(shù)量和活性。[23]此外，土壤中有效磷的增加可以促使大豆根瘤的形成，有利于大豆根系的生長發(fā)育，增加大豆根系分泌物，進而改變大豆根際環(huán)境，使大豆根際形成適宜微生物生長發(fā)育的環(huán)境。而少量施入磷肥有助于土壤團聚體的形成，改良土壤結構，為微生物生長繁殖提供了良好的條件[24-25]，在0～20cm土層，增加數(shù)量最多的為真菌數(shù)量，是因為磷肥的施入增加土壤酸性，形成適宜真菌生長發(fā)育的酸性環(huán)境，從而使土壤中真菌數(shù)量增加明顯。研究結果還表明，黔豆10號土壤的微生物數(shù)量對施磷肥的響應最明顯，其中0～20cm土層黔豆10號細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加37.28%、44.34%、56.97%，20～40cm土層黔豆10號細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加47.64%、61.6%、75.22%，說明在低磷條件下，黔豆10號具有更好的適應性和生產(chǎn)潛力。

土壤酶是土壤微生物活性的重要組成部分，是催化一系列生理生化反應、促進物質循環(huán)和能量流動的重要物質，其活性與植物生長密切相關。[26-28]有研究表明，施肥能夠顯著影響土壤中酶活性，磷添加能顯著增加土壤過氧化氫酶活性，并能不同程度的抑制根際與非根際土壤脲酶活性。[29]本研究結果表明，在施加磷肥時，大豆成熟期土壤中蔗糖酶活性增加，這主要與種植豆科植物有關。因為蔗糖酶活性受土壤氮含量影響，大豆具有固氮作用，施肥后根系的固氮能力會增加，進而增加土壤中氮含量以促進蔗糖酶活性增加。此外，有研究也表明細菌數(shù)量與蔗糖酶活性有明顯的正相關關系，本研究中細菌數(shù)量增加也說明了這一點。本研究中，施磷肥使黔豆10號土壤的蔗糖酶和過氧化氫酶活性升高明顯，分別升高93%和33%，說明在低磷條件下，黔豆10號能通過調節(jié)土壤微生物數(shù)量與酶活性，更好地適應土壤環(huán)境的變化。在0～20cm土層中，不施磷肥土壤的酸性磷酸酶活性均高于施磷肥土壤酸性磷酸酶活性，這與Wang等[30]提出的單施磷肥對酶活性有明顯抑制作用這一結論基本一致，因為施入磷肥后，土壤中游離的磷酸含量升高太多，導致磷酸酶活性降低，或者與土壤中有效鉀含量低有關，因為土壤中有效鉀含量過低時，增加磷素會降低土壤磷酸酶的活性。[31]但本研究中，施磷肥后酸性磷酸酶活性降低的機理仍尚不清楚，具體原因有待進一步分析。20～40cm土層中，同一大豆品種的酸性磷酸酶活性在不同處理之間大多沒有顯著差異，可能是因為施入的磷肥并沒有對下層土壤產(chǎn)生作用，也有可能是因為大豆根系短，沒有延伸到該層，缺少根際作用，具體原因有待進一步分析。本研究中，施加磷肥在一定程度上會降低土壤脲酶的活性，這與王朋超等[29]和賀根和等[32]的研究結果基本一致。脲酶活性降低可顯著減少土壤中養(yǎng)分流失，而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，常常需要使用脲酶抑制劑來抑制脲酶活性以降低氮肥的損失，研究結果表明，可在一定范圍內(nèi)向土壤施加磷肥來達到降低脲酶活性的目的。

研究中測定的土壤微生物數(shù)量與酶活性之間是存在一定的相關性，證實了大部分土壤酶來自土壤微生物的說法，這可能是土壤形成有利于微生物生長發(fā)育的環(huán)境，加上表層土壤水熱及通氣情況較好，營養(yǎng)充分，使土壤微生物生長旺盛、代謝活躍，從而增加相應酶的活性。研究通過分析施磷肥對大豆成熟期土壤微生物數(shù)量及酶活性的影響，揭示土壤磷與土壤微生物、酶活性之間的相互關系，結果表明施磷肥能顯著提高土壤中微生物的數(shù)量，增強過氧化氫酶和蔗糖酶的活性，減少土壤中養(yǎng)分流失，在一定程度上提高了土壤肥力，[33]其中，黔豆10號土壤微生物數(shù)量和酶活性對施用磷肥響應最明顯，研究可為大豆合理施肥、優(yōu)異基因挖掘以及低磷條件下高產(chǎn)大豆新品種的選育提供依據(jù)。

3.2 結論

不同處理不同土層的微生物數(shù)量均表現(xiàn)為細菌>放線菌>真菌；0～20cm、20～40cm土層中施磷肥均能顯著增加土壤細菌、真菌、放線菌的數(shù)量；細菌、真菌、放線菌數(shù)量均隨土層的深入而減少。施磷肥能增加大豆成熟期土壤的蔗糖酶活性，降低土壤酸性磷酸酶和土壤脲酶的活性，對大部分土壤的過氧化氫酶的影響不明顯；所測定的土壤酶的活性均隨土層的深入而降低。

與不施磷肥處理相比，施磷肥使黔豆10號微生物數(shù)量增加最多，其中0～20cm土層黔豆10號細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加37.28%、44.34%、56.97%；20～40cm土層黔豆10號細菌、放線菌、真菌數(shù)量分別增加47.64%、61.6%、75.22%。施磷肥使黔豆8號土壤的脲酶與酸性磷酸酶活性降低最明顯，分別降低23%和38%；施磷肥使黔豆10號土壤的蔗糖酶和過氧化氫酶活性升高明顯，分別升高93%和33%。

在0～20cm土層中，土壤中的細菌、真菌、放線菌數(shù)量與土壤過氧化氫酶、酸性磷酸酶活性顯著相關(P<0.05)，細菌和放線菌數(shù)量與蔗糖酶活性顯著相關(P<0.05)。20～40cm土層中，土壤中的細菌、真菌、放線菌數(shù)量與酸性磷酸酶及蔗糖酶活性顯著相關，其中與酸性磷酸酶呈顯著正相關，與蔗糖酶活性呈顯著負相關。