賈艷萍，謝秀春，賈毛毛，馬丹陽(yáng)，羅世杰，馮愛(ài)民*

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）為新生兒期一種嚴(yán)重的胃腸道疾病，是導(dǎo)致新生兒腸穿孔及全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemin inflammatory response,SIRS）的主要原因之一[1]，也是導(dǎo)致新生兒死亡的重要病因[2]。

隨著早產(chǎn)兒存活率的不斷提高，NEC 發(fā)病率明顯增加，在低出生體質(zhì)量?jī)褐屑s為2.50%，在極低出生體質(zhì)量?jī)褐屑s為4.53%[3]，病死率高達(dá)15%～30%[4]，尚無(wú)特效防治手段。NEC 確切的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為，NEC 的發(fā)生主要由于多種致病因素綜合作用于發(fā)育尚不成熟的胃腸道，使腸黏膜局部缺血，腸道蠕動(dòng)功能減弱，食物在腸腔內(nèi)滯留，致胃腸功能紊亂，使致病菌繁殖，引起腸道炎癥反應(yīng)，激發(fā)炎癥風(fēng)暴。如腸壁缺血/缺氧及再灌注損傷[5-6]、早產(chǎn)[7-8]及低出生體質(zhì)量[9]、感染及炎癥反應(yīng)[10-11]、喂養(yǎng)不當(dāng)[12]等綜合影響下導(dǎo)致NEC 的發(fā)生。在上述各致病因素的作用下，NEC 引起腸道功能障礙，造成腸道內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜下水腫、出血，消化道絨毛結(jié)構(gòu)破壞，甚至穿孔或壞死等病理改變，發(fā)生敗血癥、感染性休克等嚴(yán)重并發(fā)癥[13]。因此NEC 的恰當(dāng)治療對(duì)提高生存率，改善預(yù)后至關(guān)重要。

現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，大黃具有保肝利膽[14]、抑制多種菌種[15]、瀉下、活血、止血、調(diào)節(jié)血脂[16]、保護(hù)腸道黏膜屏障、降低腸道細(xì)菌移位率[17]等作用。本課題對(duì)生大黃粉治療新生鼠NEC 的效果進(jìn)行了研究，同時(shí)，通過(guò)對(duì)腸組織勻漿胃動(dòng)素（MTL）和促胃液素（GAS）含量的測(cè)定，探討其治療機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用生大黃粉治療新生兒NEC 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 早產(chǎn)兒配方奶粉（特別能恩）由雀巢公司提供；湯臣倍健蛋白粉購(gòu)自湯臣倍健股份有限公司；脂肪乳注射液（C14-C24）由華瑞制藥有限公司提供；脂多糖（LPS）購(gòu)自北京Solarbio 公司；CY-12C 型便攜式數(shù)字測(cè)氧儀；大鼠GAS ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：YX-O72000R）、大鼠MTL ELISA 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：YX-132012R）；醫(yī)用純氮?dú)猓杭兌取?9.9%，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；醫(yī)用純氧氣：由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制氧站提供；生大黃粉購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室，生大黃粉液配制方法：大、中、小劑量組分別取2.04、1.02、0.51 g 生大黃粉，分別直接加入15 mL 熱水中，0.1 mL 生大黃粉液中含生大黃劑量分別為0.013 6 g，0.006 8 g，0.003 4 g。

1.2 動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)新生2 d 齡SD 大鼠72 只，生產(chǎn)許可證：SCXK（川）2015-030，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將體質(zhì)量5～12 g 新生大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組，每組12 只。A 組僅接受人工喂養(yǎng)；B 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧冷刺激+LPS+生理鹽水；C 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧冷刺激+LPS+西咪替?。籇 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧冷刺激+LPS+大劑量生大黃；E 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧冷刺激+LPS+中劑量生大黃；F 組接受人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧冷刺激+LPS+小劑量生大黃。

1.3 方法

1.3.1 人工喂養(yǎng) 新生SD 大鼠在出生后48 h 置于保育箱內(nèi)（溫度28～30 ℃，濕度45%～65%），采用代乳品人工喂養(yǎng)，代乳品配制見(jiàn)表1，每100 mL 代乳品添加早產(chǎn)兒奶粉6.0 g，蛋白粉10.7 g，脂肪乳48.9 mL，總熱量約7020 kJ，采用6 號(hào)灌胃針定時(shí)經(jīng)口插管喂養(yǎng)，第1 天給予0.2 mL/6 h，隨后每24 h 增加0.1 mL，48 h 后逐漸增至0.4 mL。

表1 人工喂養(yǎng)代乳品配方與鼠乳主要成分的比較

1.3.2 缺氧、復(fù)氧及冷刺激 CY-12C 型測(cè)氧儀調(diào)零后，將探頭連接至缺氧箱出口處，入口處充入氮?dú)?，打開(kāi)氮?dú)夤蘖髁勘?，控制氮?dú)饬髁繛?5 L/min，當(dāng)缺氧箱氧濃度為零時(shí)迅速將除A 組外余60 只新生鼠置入，90 s 后關(guān)閉氮?dú)忾y，打開(kāi)缺氧箱，取出新生鼠，隨后將其置入含100%氧氣的復(fù)氧箱中，10 min 后將新生鼠置于4 ℃冰箱冷藏，持續(xù)10 min 后放回保育箱，每日2 次，連續(xù)3 d。

1.3.3 LPS 腹腔注射LPS 0.1 mL（10 mg/kg），每日1 次，連續(xù)3 d。

1.3.4 藥物治療 B 組灌胃生理鹽水0.1 mL，C 組灌胃西咪替丁0.1 mL（相當(dāng)于0.000 34 mg），D 組每次灌胃生大黃粉液0.1 mL（含生大黃13.6 mg），E 組每次灌胃生大黃粉液0.1 mL（含生大黃6.8 mg），F(xiàn) 組每次灌胃生大黃粉液0.1 mL（含生大黃3.4 mg），均間隔8 h 給藥1 次，連續(xù)3 d。

1.3.5 組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 所有動(dòng)物于第4 天空腹頸椎脫臼處死，取回盲部近端腸組織上下各1 cm 立即固定，脫水，石蠟包埋，切片及HE 染色，參照文獻(xiàn)[18]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行雙盲腸組織病理評(píng)分：0 分為腸絨毛及上皮完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1 分為輕度黏膜下和（或）固有層腫脹分離；2 分為中度黏膜下和（或）固有層腫脹分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫；3 分為重度黏膜下和（或）固有層腫脹分離，黏膜下和（或）肌肉層水腫，局部絨毛脫落；4 分為腸絨毛消失和（或）伴腸壞死；組織評(píng)分≥2 分，確定為NEC。

1.3.6 腸組織GAS、MTL 含量檢測(cè) 將剩余腸組織置于冰生理鹽水中漂洗、濾紙拭干稱(chēng)重，冰浴下制作10%腸組織勻漿，4 ℃低溫離心，3 500 r/min，離心15 min，取上清液分裝于EP 管中，置于-80℃冰箱中待測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組新生鼠MTL、GAS 含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，治療前后各組之間采用單因素方差分析（ANOVA），方差齊者用LSD 比較，方差不齊者用Tamhane′s 比較，等級(jí)資料用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)；以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及體質(zhì)量變化

2.1.1 一般情況 B 組、C 組、D 組、E 組、F 組在造模后新生鼠均出現(xiàn)活動(dòng)減少，倦怠，反應(yīng)遲鈍，喂養(yǎng)困難、吐奶及胃潴留，腹部脹滿(mǎn)，進(jìn)而可見(jiàn)大便顏色性狀發(fā)生改變，均不同程度排黃綠便或黑色稀便。除A組外，余各組在缺氧過(guò)程中新生鼠均出現(xiàn)煩躁、抽搐、呼吸困難、紫紺、大小便失禁。復(fù)氧后新生鼠逐漸恢復(fù)自主活動(dòng)，膚色轉(zhuǎn)紅，其中D 組、E 組、F 組復(fù)氧需幾十秒至1 min 不等，B 組、C 組復(fù)氧約需3 min；冷刺激10 min 后，新生鼠出現(xiàn)全身皮膚冰冷，黏膜蒼白，立即置于保育箱保暖，D 組、E 組、F 組膚色不足1 min 恢復(fù)，B 組、C 組約2～3 min 膚色恢復(fù)。A 組活動(dòng)度可，納乳及排便正常，無(wú)腹脹及腹瀉。

2.1.2 各組實(shí)驗(yàn)前后NEC 動(dòng)物體質(zhì)量比較 各組新生鼠實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量，見(jiàn)表2。經(jīng)單因素方差分析（ANOVA），實(shí)驗(yàn)前A 組、B 組、C 組、D組、E 組、F 組新生鼠體質(zhì)量相似（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)LSD 多重比較進(jìn)一步推斷，各組間體質(zhì)量比較：A 組＞E 組＞D 組＞F 組＞C 組，B 組與C組體質(zhì)量無(wú)差異。結(jié)果表明，生大黃（粉）及西咪替丁對(duì)NEC 大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)有改善作用，且前者優(yōu)于后者，見(jiàn)表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)前后NEC 動(dòng)物體質(zhì)量及其差值比較（，n =12） g

表2 各組實(shí)驗(yàn)前后NEC 動(dòng)物體質(zhì)量及其差值比較（，n =12） g

注：與其他各組比較，# P ＜0.05

2.2 新生鼠腸組織HE 染色病理學(xué)改變 用HE 染色法記錄新生鼠腸組織回盲部形態(tài)變化，光鏡下可觀察到D 組、E 組、F 組腸絨毛生長(zhǎng)旺盛，結(jié)構(gòu)相對(duì)整齊，部分輕度水腫，黏膜下層和固有層輕度分離，分離程度較B 組、C 組明顯減輕（圖1-D、圖1-E、圖1-F）；B 組、C 組新生鼠腸組織損傷嚴(yán)重，黏膜下層和固有層腫脹分離明顯，腸絨毛水腫，黏膜下層及固有層可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-B、圖1-C）；A 組腸組織結(jié)構(gòu)完整清晰，黏膜層、黏膜下層及固有層未見(jiàn)明顯分離，且無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-A）。

圖1 NEC 模型治療后各組新生鼠腸組織（HE，×100）

2.3 不同干預(yù)方式對(duì)NEC 動(dòng)物模型病理評(píng)分的比較 新生鼠腸組織病理評(píng)分結(jié)果，見(jiàn)表3。由于腸組織病理評(píng)分為等級(jí)資料，不符合正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)后，P＜0.05，故各組間病理評(píng)分存在顯著差異；D 組、E 組、F 組之間比較結(jié)果顯示，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 不同干預(yù)方式對(duì)NEC 動(dòng)物模型病理評(píng)分的比較（，n =12）

表3 不同干預(yù)方式對(duì)NEC 動(dòng)物模型病理評(píng)分的比較（，n =12）

注：與B 組比較，# P ＜0.05

2.4 各組腸組織勻漿中MTL、GAS 含量比較 各組新生鼠腸組織MTL、GAS 含量見(jiàn)表4，各組間MTL含量比較：A 組＞D 組＞C 組＞B 組，A 組＞E組＞C 組＞B 組，A 組＞F 組＞C 組＞B 組，D 組、E 組及F 組之間MTL 含量相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明缺氧等腸損傷后，腸組織內(nèi)MTL 表達(dá)降低，經(jīng)生大黃粉治療后，可使腸組織中MTL 升高；各組間GAS 含量比較：B 組＞C 組＞D 組＞A 組，B 組＞C組＞E 組＞A 組，B 組＞C 組＞F 組＞A 組，D 組、E 組及F 組之間GAS 含量相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明缺氧等腸損傷后，腸組織內(nèi)GAS 表達(dá)升高，經(jīng)生大黃粉治療后，可使腸組織中GAS 表達(dá)降低。

表4 各組腸組織勻漿中MTL、GAS 含量比較（，n =12） pg/mL

表4 各組腸組織勻漿中MTL、GAS 含量比較（，n =12） pg/mL

注：與B 組比較，# P ＜0.05

3 討論

中醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有特定的“壞死性小腸結(jié)腸炎”病名，根據(jù)患者表現(xiàn)出的“腹脹、便秘、嘔吐”等癥狀，當(dāng)屬中醫(yī)“痞滿(mǎn)”“便秘”“嘔吐”“呃逆”等范疇，其病位在脾、胃、大腸、小腸等。壞死性小腸結(jié)腸炎的病因尚不明確，多認(rèn)為與初生兒、胎怯兒先天稟賦不足，臟腑嬌嫩，形氣未充有關(guān)。壞死性小腸結(jié)腸炎的根本病機(jī)是氣機(jī)逆亂、脾胃功能失調(diào)。NEC 的內(nèi)科治療以禁食、胃腸減壓、胃腸外營(yíng)養(yǎng)、有效抗菌藥物抗感染、液體復(fù)蘇、輔助通氣等對(duì)癥支持治療為主[19-20]，外科主要通過(guò)手術(shù)治療。在西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，生大黃粉對(duì)NEC 有非常顯著的防治作用[21]，其作用機(jī)制與抑制NF-κB P65 蛋白表達(dá)相關(guān)，大黃上清液可抑制Caco-2 炎癥細(xì)胞Toll 樣受體的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。

生大黃性味苦寒，入脾、胃、肝、大腸、心包經(jīng)；能下瘀血、通血閉；推陳致新，破癥瘕積聚，除留飲宿食；攻積導(dǎo)滯，宣通氣機(jī)；調(diào)暢脾胃氣機(jī)，具有瀉下作用；生大黃調(diào)暢脾胃氣機(jī)的作用與壞死性小腸結(jié)腸炎氣機(jī)逆亂，脾胃功能失調(diào)相契合。諸多研究證實(shí)，生大黃對(duì)胃腸道調(diào)節(jié)作用明顯。研究表明，大黃具有減輕氧自由基損害，抑制腸道炎癥反應(yīng)[22]，促進(jìn)平滑肌收縮，保護(hù)消化道黏膜，增加胃動(dòng)力，促進(jìn)止血等作用[23]。

MTL 和GAS 是對(duì)胃腸功能有重要調(diào)節(jié)作用的激素。MTL 作用于消化系平滑肌上的胃動(dòng)素受體，導(dǎo)致平滑肌收縮加強(qiáng)，加速胃排空和縮短食物在小腸內(nèi)的停留時(shí)間，起著“清道夫”的作用[24-25]。GAS 是由胃竇及十二指腸和空腸上段黏膜中G 細(xì)胞分泌的一種胃腸激素，其主要生理作用是刺激胃腸道的分泌，使胃酸、胃蛋白酶分泌增加，促進(jìn)胃粘膜血流量增加、胃平滑肌收縮[26-27]。它能促進(jìn)胃的運(yùn)動(dòng)，也能增強(qiáng)幽門(mén)括約肌的收縮，其總效應(yīng)是延緩胃排空。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，生大黃治療組MTL 升高、GAS 降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與西咪替丁組比較，生大黃治療組中MTL 表達(dá)高于西咪替丁組，GAS 表達(dá)低于西咪替丁組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；生大黃各劑量組之間比較，MTL、GAS表達(dá)相似，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HE染色結(jié)果顯示，生大黃治療組腸絨毛結(jié)構(gòu)相對(duì)整齊，部分輕度水腫，黏膜下層和固有層輕度分離，生理鹽水組、西咪替丁組腸組織損傷嚴(yán)重，黏膜下層和固有層腫脹分離明顯，腸絨毛水腫，黏膜下層及固有層可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；生大黃治療組其病理評(píng)分均值低于生理鹽水組及西咪替丁組，且相同實(shí)驗(yàn)因素下其發(fā)病率明顯減低。

綜上所述，生大黃粉能夠降低新生鼠NEC 模型腸損傷程度，且效果優(yōu)于西咪替丁，提示生大黃粉有可能成為防治NEC 的一種有效藥物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示不同劑量生大黃對(duì)腸損傷病理切片改善無(wú)明顯差異，且生大黃作為單味中藥，目前對(duì)其吸收代謝、作用機(jī)制、藥物效果的研究還不全面，特別是在治療NEC 方面僅處于探索階段，還需要大量研究奠定基礎(chǔ)。