張新鵑 孫 龍 王海風(fēng) 姜旭光

1.山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校西醫(yī)教學(xué)部，山東煙臺(tái) 264199；2.山東省臨沂市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，山東臨沂 276400

膠質(zhì)瘤是人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤最常見(jiàn)的一種，目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療主要以手術(shù)切除為主。而高級(jí)別膠質(zhì)瘤尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，因其富集血管且彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，所以治療效果很差。隨著分子生物學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、生物技術(shù)等進(jìn)步出現(xiàn)了分子靶向治療，即從分子水平針對(duì)關(guān)鍵基因、細(xì)胞受體和調(diào)控分子為靶點(diǎn)治療。分子靶向治療目前已經(jīng)在臨床應(yīng)用于膠質(zhì)瘤患者，并取得不錯(cuò)的治療效果，這給膠質(zhì)瘤的治療帶來(lái)了新的希望。因此，尋找有效靶點(diǎn)將非常有利于膠質(zhì)瘤的臨床治療。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，HER4（又稱(chēng)erbB4）與某些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常腦組織和病理級(jí)別不同的膠質(zhì)瘤組織中的HER4表達(dá)情況，來(lái)研究HER4在膠質(zhì)瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用，為膠質(zhì)瘤的研究提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取88例膠質(zhì)瘤標(biāo)本為臨沂市中心醫(yī)院病理科存檔、且在2008年1月～2009年12月接受手術(shù)治療的初發(fā)患者，由該院病理科資深醫(yī)師對(duì)所有膠質(zhì)瘤標(biāo)本核查和篩選，并依照WHO 中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[2]對(duì)標(biāo)本行病理分級(jí)（Ⅰ～Ⅳ級(jí)）：Ⅰ級(jí)8例，Ⅱ級(jí)25例，Ⅲ級(jí)33例，Ⅳ級(jí)22例。其中，Ⅰ、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤。另取該院腦外傷患者開(kāi)顱減壓術(shù)切除的正常腦組織標(biāo)本14例為對(duì)照組，本研究經(jīng)臨沂市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬同意。將全部組織標(biāo)本制成病理切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和方法

主要試劑：鼠抗人HER4 單克隆抗體HFR-1：英國(guó)Abcam公司（批號(hào)GR256899-7）；免疫組化試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB 顯色劑：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

實(shí)驗(yàn)方法：將石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，以蒸餾水漂洗5 min，切片置于0.01 mol/L 枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中進(jìn)行高溫抗原修復(fù)2 min，并自然冷卻25 min，冷水沖洗缸子可加快冷卻。取出切片，以蒸餾水沖洗2次、每次3 min，之后用PBS 液反復(fù)沖洗，共3次、每次3 min。然后用3%濃度的H2O2浸泡10 min 以阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS 液沖洗3次、每次3 min。擦干周?chē)腜BS 液后用山羊血清封閉，37℃孵育30 min。去除周?chē)难搴蟮渭右豢梗ㄏ♂尪葹?∶200），保存在4℃冰箱，過(guò)夜。按照試劑盒使用說(shuō)明操作（陽(yáng)性乳腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照、PBS 液代替一抗作為陰性對(duì)照），PBS 液洗3次、每次5 min，擦干周?chē)腜BS液后滴加DAB 顯色劑，清水沖洗后進(jìn)行蘇木精復(fù)染色。蒸餾水充分沖洗后脫水、干燥、封片。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判斷

以細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃、棕黃或棕褐色深淺不等的顆粒為HER4陽(yáng)性表達(dá)，觀察每高倍鏡（400×）視野中陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分比：陰性為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%，陽(yáng)性為≥5%。

采用IPP 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行免疫組織化學(xué)法半定量分析：高倍鏡（400×）下隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)量其積分光密度（IOD）值，即將圖像上陽(yáng)性點(diǎn)的光密度值加起來(lái)，測(cè)量選取的區(qū)域面積（area）。最后，計(jì)算光密度平均值（IOD/area）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HER4陽(yáng)性表達(dá)率

膠質(zhì)瘤組織為61.4%（54/88），正常腦組織為14.3%（2/14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.812，P=0.001）。

2.2 HER4在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核陽(yáng)性的表達(dá)

其表達(dá)量隨膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的提高而增加，詳見(jiàn)圖1（封三）。正常腦組織中HER4表達(dá)的IOD/area值為0.09±0.02，低級(jí)別膠質(zhì)瘤IOD/area值為0.20±0.03，高級(jí)別膠質(zhì)瘤IOD/area值為0.31±0.08；低級(jí)別膠質(zhì)瘤IOD/area值高于正常腦組織（P<0.05），而高級(jí)別膠質(zhì)瘤IOD/area值又高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 HER4在正常腦組織及不同病理分級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（400×）

3 討論

HER4 基因首先是由Lai 和Lemke 于1991年在新生鼠神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)現(xiàn)的，并發(fā)現(xiàn)該基因在新生鼠神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中普遍表達(dá)[3]。1993年，Plowman 等[4]克隆出人體組織中的該基因，并發(fā)現(xiàn)它是編碼I型受體酪氨酸激酶（RTK）家族第4個(gè)成員HER4 的基因，蛋白分子量為18 OKD。作為跨膜受體蛋白的HER4，其調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、增殖、血管生成和凋亡的機(jī)制為：HER4 與配體結(jié)合后可通過(guò)自身磷酸化參與到細(xì)胞的信號(hào)傳遞過(guò)程中，信號(hào)通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)傳遞發(fā)揮作用。HER4在正常人體除甲狀腺、腎小球及外周神經(jīng)以外的全身組織中均有不同程度的表達(dá)，但均較少[5]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究HER4 與惡性腫瘤間關(guān)系的并不在少數(shù)，而結(jié)果卻不盡相似。近年大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)：HER4 的過(guò)度表達(dá)出現(xiàn)在多種惡性腫瘤組織中，多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展都有HER4 的參與、調(diào)控[6-11]。國(guó)內(nèi)幾項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌、結(jié)腸癌、肝內(nèi)膽管癌中不僅有HER4 的高表達(dá)，且HER4表達(dá)情況與這些腫瘤的臨床分期緊密相關(guān)[12-14]；同期國(guó)外的另幾項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤、原發(fā)性顱內(nèi)腦膜瘤及鼻腔黏膜惡性黑色素瘤也有HER4 的高表達(dá)，HER4表達(dá)與這些腫瘤病理分級(jí)成正相關(guān)[15-16]。而早些的研究卻出現(xiàn)過(guò)相反情況：普通痣中HER4陽(yáng)性表達(dá)率最高，而HER4的陽(yáng)性表達(dá)率在異常增生痣、黑色素瘤中卻逐級(jí)降低[17]。另一研究表明，涎腺黏液表皮樣癌雖有HER4 高表達(dá)，但HER4表達(dá)與病理組織學(xué)分級(jí)兩者間的關(guān)系卻明顯負(fù)相關(guān)[18]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于膠質(zhì)瘤中HER4表達(dá)情況的研究少見(jiàn)。本研究結(jié)果顯示，HER4在膠質(zhì)瘤中存在高表達(dá)，與正常腦組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且HER4 的表達(dá)量隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的升高相應(yīng)增加。這與近年來(lái)的大多數(shù)研究結(jié)果近似。由此可推斷：HER4在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，HER4 可作為評(píng)價(jià)膠質(zhì)瘤惡性程度的重要生物學(xué)指標(biāo)；HER4 也有望成為膠質(zhì)瘤分子靶向治療的新靶點(diǎn)。