李 孟 張靖柯 石靜亞 湯迎迎 孫彥君
1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,河南鄭州 450046;2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,河南鄭州 450046
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)為菊科植物菊的干燥頭狀花序,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品。其味甘、苦,性微寒,主歸肺、肝經(jīng),具有疏散風(fēng)熱、平肝明目、清熱解毒的功效[1-2]。菊花作為我國(guó)傳統(tǒng)的一味中藥材,種類(lèi)繁多,分布廣泛,具有很高的藥用價(jià)值。菊花在藥用和保健方面都有很好的效果,是我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的第一批藥食兩用藥材。目前國(guó)內(nèi)對(duì)菊花的應(yīng)用研究較多,對(duì)菊花莖葉的綜合利用研究相關(guān)報(bào)道較少,大量菊花莖葉因其藥用保健價(jià)值未能充分開(kāi)發(fā)利用而遭丟棄。
2015版《中華人民共和國(guó)藥典》新增“懷菊花”這一品種,與“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”共同作為“菊花”入藥,肯定了懷菊的藥用地位。文獻(xiàn)研究表明,懷菊花及其莖葉均含有以單萜類(lèi)和倍半萜類(lèi)及其含氧衍生物為主的揮發(fā)油類(lèi)成分、黃酮類(lèi)成分等[3-4]。為了全面探究懷菊花及其莖葉的化學(xué)成分,本研究采用索氏提取法提取其脂溶性成分,并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法對(duì)其脂溶性成分組成進(jìn)行鑒定分析,同時(shí)采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力的方法測(cè)定其脂溶性成分的抗氧化活性,以期為懷菊花整株資源的綜合有效利用提供科學(xué)依據(jù)。
Agilent7890/7000B三重串聯(lián)四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司);BT-25S型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司);AB204-N型萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)梅特勒公司);索氏提取器(南京金正玻璃儀器廠);調(diào)溫試電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);N1100VWD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛(ài)朗儀器有限公司)。分析純石油醚(沸程60~90℃)、甲醇、正己烷無(wú)水硫酸鈉、三氟化硼均為分析純。
菊花及其莖葉采自河南焦作,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠(chéng)明教授鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的花和莖葉,晾干,待用。
取1.2項(xiàng)下的樣品,粉碎成粗粉備用。稱(chēng)取各樣品10g,以石油醚為溶劑,80℃索氏提取6h,提取液減壓濃縮,得提取物,菊花為淺黃色油狀物,菊花莖葉為淺綠色油狀提取物。加入0.5mol/L氫氧化鉀甲醇溶液,60℃恒溫水浴30min,冷卻后加入三氟化硼甲醇溶液5mL,于60℃水浴,加熱回流5min,冷卻,加正己烷和飽和氯化鈉水溶液各2mL,取上清液加無(wú)水Na2SO4干燥,取樣分析。
2.2.1 氣相色譜條件 色譜柱為HP-FFAP型石英毛細(xì)管柱(30mm×0.25mm,0.25μm),載氣為高純氦氣(99.999%),氦氣流速1.0mL/min;進(jìn)樣口溫度為240℃;分流;升溫程序?yàn)?0℃保持2min,按10℃/min升溫至190℃,保持2min,以2℃/min升溫至230℃,保持15min,氣化室溫度為280℃,接口溫度為240℃。
2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源:電子轟擊源,電子能量70eV;掃描范圍m/z30~600AMU,離子源溫度230℃,溶劑延遲:4.5min,GC-MS接口溫度240℃。
用NIST98系統(tǒng)譜庫(kù)自動(dòng)檢索組分的質(zhì)譜,結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn),分別與八峰索引、EPA/NIH相對(duì)照,匹配度均在80%以上?;衔锏亩渴褂肏ewlettPackard軟件按峰面積歸一化法計(jì)算相對(duì)含量[5]。
采用清除自由基的方法測(cè)定脂溶性成分的抗氧化能力[6]:DPPH自由基清除活性測(cè)定采用96孔板法,不同濃度的樣品液及維生素C各取100μL放置于96孔板中,再添加100μL DPPH自由基溶液,在室溫中反應(yīng)30min后采用酶標(biāo)儀測(cè)定其在517nm處的吸光度值。清除率的計(jì)算公式為:
清除率=[(A0-Ai)/A0]×100%
其中,A0表示空白組吸光度,Ai為樣品組的吸光度,所有測(cè)定操作重復(fù)3次,取平均值。
依照上述條件對(duì)懷菊花及其莖葉的脂溶性成分進(jìn)行分析,得出的總離子流圖見(jiàn)圖1,其脂溶性成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。從懷菊花和懷菊莖葉中共鑒定出69個(gè)脂溶性成分,其中懷菊花鑒定出56個(gè)成分,檢出成分相對(duì)含量占91.19%;懷菊莖葉鑒定出37個(gè)成分,檢出成分相對(duì)含量占85.10%。
懷菊花的脂溶性成分主要有脂肪酸類(lèi)(45.70%)、烷烴類(lèi)(24.10%)、萜類(lèi)(15.41%)以及少量的醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)等,主要成分(相對(duì)含量>5.00%)有棕櫚酸甲酯(10.41%)、肉豆蔻酸甲酯(7.85%)、二十一烷(9.32%)、二十五烷(6.66%)、亞油酸甲酯(6.57%);懷菊莖葉的脂溶性成分主要是脂肪酸類(lèi)成分(76.87%)以及少量的萜類(lèi)等,其中不飽和脂肪酸占懷菊莖葉脂溶性成分的44.15%,飽和
脂肪酸占懷菊莖葉脂溶性成分的32.72%,主要成分(相對(duì)含量>5%)為亞麻酸甲酯(29.16%)、棕櫚酸甲酯(18.47%)和亞油酸甲酯(11.68%)。由此看出,懷菊花和其莖葉的脂溶性成分差異較大。而懷菊花和莖葉的脂溶性成分,共有峰是24個(gè),分別占其相對(duì)含量的50.56%和81.78%,說(shuō)明其脂溶性成分同時(shí)也具有一定的相似性。
表1 懷菊花及其莖葉脂溶性成分GC-MS分析
續(xù)表
表2 懷菊花及其莖葉脂溶性成分對(duì)DPPH自由基清除能力(%)
清除DPPH自由基能力的試驗(yàn)結(jié)果提示,懷菊花和莖葉脂溶性成分對(duì)DPPH有一定的清除作用,且隨著濃度的增加,清除率也隨之上升,有明顯的量效關(guān)系,見(jiàn)表2,其對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50分別為9.76mg/mL和7.96mg/mL。
從懷菊花和懷菊莖葉中,共鑒定出69個(gè)脂溶性成分,共有成分24種,懷菊花的脂溶性成分主要為脂肪酸類(lèi)、烷烴類(lèi)和萜類(lèi),懷菊莖葉主要是脂肪酸類(lèi)?;钚越Y(jié)果提示,其脂溶性成分具有一定的抗氧化活性。
菊花始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,具有疏散風(fēng)熱、平肝明目、清熱解毒的功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,菊花具有改善心肌營(yíng)養(yǎng)、去除活性氧自由基、加強(qiáng)毛細(xì)血管的抵抗力、降低血液中脂肪和膽固醇的含量、抑制腫瘤、延緩衰老及增強(qiáng)人體免疫力等功效。懷菊花作為“四大懷藥”之一,主產(chǎn)于河南武陟、溫縣地區(qū),種植的歷史較悠久,為河南道地藥材[7]。課題組前期對(duì)懷菊花的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,從中得到了一系列愈創(chuàng)木烷型倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、糖苷類(lèi)等化合物[8-10],劉曉薇等[11]對(duì)懷菊花的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)懷菊花中的揮發(fā)性成分主要為單萜類(lèi)和倍半萜類(lèi)及其含氧衍生物。目前對(duì)菊花莖葉化學(xué)成分的研究主要集中在揮發(fā)油[12]、黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)及多糖類(lèi)成分等方面,研究和開(kāi)發(fā)利用相對(duì)較少,其資源的處置多為棄去或做飼料用,造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。
本研究采用GC-MS對(duì)懷菊花和其莖葉的脂溶性成分進(jìn)行分析,從懷菊花和懷菊莖葉中共鑒定出69個(gè)脂溶性成分,懷菊花鑒定出56個(gè),懷菊莖葉鑒定出37個(gè),共有成分24個(gè),分別占其相對(duì)含量的50.56%和81.78%。懷菊花的主要成分是棕櫚酸、肉豆蔻酸、二十一烷、二十五烷、亞油酸等;懷菊莖葉的主要成分是亞麻酸(29.16%)、棕櫚酸(18.47%)、亞油酸(11.68%)等。亞麻酸作為人體必需脂肪酸,只能通過(guò)食物攝取,是合成前列腺素的前體,參與脂肪代謝,與視力、腦發(fā)育和行為發(fā)育有關(guān);棕櫚油酸對(duì)肥胖癥、糖尿病和脂肪肝等具有一定的療效,且對(duì)傷口發(fā)炎具有抑制效果以及改善皮膚光滑度等[13];亞油酸是人體自身不能合成但必需的不飽和脂肪酸,具有降低血脂、防止動(dòng)脈粥樣硬化及預(yù)防脂肪肝、抑制血栓形成的功效[14]。另外,懷菊花中鑒定出單萜和倍半萜類(lèi)化合物20余種(15.41%)、烷烴類(lèi)7個(gè)(24.1%),這是與懷菊莖葉的主要差異成分,說(shuō)明兩者的脂溶性成分具有一定的差異性。
劉東順等[15]對(duì)菊花、葉、莖的水提物和醇提物抗氧化活性的研究表明,菊花、葉和莖提取物均有較強(qiáng)的抗氧化活性,菊葉抗氧化作用與菊花相當(dāng)。本研究采用DPPH法測(cè)定懷菊花和莖葉脂溶性成分的抗氧化能力,結(jié)果提示,懷菊花和莖葉的脂溶性成分均具有抗氧化活性。本研究從化學(xué)成分的角度,進(jìn)一步說(shuō)明懷菊莖葉作為天然抗氧化劑有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值,為懷菊資源的充分利用提供科學(xué)依據(jù)。