周春權(quán) 趙 立 蔣 暢 胡 娟,2▲

1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122

“十二時(shí)辰”為毛茛科鐵線蓮屬下的一個(gè)變種植物重瓣鐵線蓮Clematis florida Thunb.var.plena D.Don的干燥根[1]。在《福安畬醫(yī)畬藥》書中有詳細(xì)記載，其味溫辛，主要功效為活血止痛、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、利尿、解毒，主治跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛，蟲蛇咬傷[2]?！笆r(shí)辰”在畬族民間應(yīng)用廣泛，其花用來泡水代茶飲，其根用來泡酒為習(xí)用藥，藥液作為抹劑，對(duì)跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛等效果良好。“十二時(shí)辰”成為福安畬族具有鮮明地方特色的民族藥。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)“十二時(shí)辰”根用水煎煮，煎煮液給小鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)其急性毒性的半數(shù)致死量（LD50）為60.08g/kg[3]。但是對(duì)其根用乙醇提取的醇提液，在皮膚上用藥，毒性又將怎樣呢？為此參照“中藥藥理研究方法學(xué)”皮膚用藥毒性試驗(yàn)方法[4]，本研究進(jìn)行了一系列的安全性實(shí)驗(yàn)，即皮膚用藥急性毒性、試驗(yàn)皮膚刺激性試驗(yàn)和皮膚過敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭家兔（上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，20170008000087），雌雄各半，體重為（1.5±0.2）kg；豚鼠（上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，311616700001569），雌雄各半，體重為（250±50）g。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

“十二時(shí)辰”醇提液：生藥由閩東畬族青草藥發(fā)展協(xié)會(huì)提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院范世明教授鑒定為毛茛科植物重瓣鐵線蓮的干燥根。醇提液制備，用65%的乙醇加熱回流提取，過濾，濾液減壓濃縮成每毫升含生藥2.0g的醇提液備用。

1.3 試劑

詩(shī)妃脫毛膏（廣州詩(shī)妃生物科技有限公司，PSHG028）；2，4-二硝基氯代苯（上海試劑一廠，批號(hào)：20050216）。

2 方法與結(jié)果

2.1 “十二時(shí)辰”皮膚用藥急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 分組與給藥 通過預(yù)試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒性反應(yīng)，則按照最大濃度最大耐受量法的原則進(jìn)行家兔急性毒性實(shí)驗(yàn)。將家兔隨機(jī)分成三組，即空白對(duì)照組（賦形劑）、完整皮膚給藥組和破損皮膚給藥組，每組各6只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前24h，先用電動(dòng)剃毛刀在背部剃毛，再用詩(shī)妃脫毛膏涂抹在背部脫毛，脫毛區(qū)面積約為150cm2。破損皮膚組的制作方法：先用75%酒精消毒，再用無菌刀片在背部脫毛區(qū)劃“井”字，以滲血為度。

分別在各組家兔的脫毛區(qū)域均勻涂抹相應(yīng)的藥物，然后用醫(yī)用紗布包扎固定。上午涂1次，6h后再涂1次，每次每只涂5mL，劑量約為12.5g/kg原藥材。給藥后詳細(xì)觀察并記錄動(dòng)物的死亡情況、體重、皮毛、飲食、呼吸、二便、眼睛、黏膜、行為改變、自主活動(dòng)改變情況，連續(xù)觀察2周。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在觀察期間，動(dòng)物無死亡，體重、皮毛、飲食、呼吸、二便、眼睛、黏膜、行為、自主活動(dòng)均正常。“十二時(shí)辰”皮膚用藥12.5g/kg原藥材，相當(dāng)于成人（以成人體重60kg計(jì)算）日用劑量為250g，未見毒性反應(yīng)。見表1。

表1 “十二時(shí)辰”皮膚用藥急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 皮膚用藥刺激實(shí)驗(yàn)

2.2.1 分組與給藥 根據(jù)“十二時(shí)辰”臨床用藥特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用同體左右側(cè)自身對(duì)比多次給藥皮膚刺激實(shí)驗(yàn)，健康成年新西蘭家兔，雌雄各半，分為四組，即“十二時(shí)辰”高劑量（1.0g/mL）完整皮膚組、破損皮膚組、“十二時(shí)辰”低劑量（0.5g/mL）完整皮膚組、破損皮膚組，每組各6只。于給藥前24h用電推剪在背部脫毛，脫毛面積約150cm2。破損皮膚組的制作方法：先用75%酒精消毒，再用無菌刀片在背部脫毛區(qū)劃“井”字，以滲血為度。使左右兩側(cè)皮膚的破損程度基本一致。每只動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，左側(cè)脫毛區(qū)涂不同濃度的“十二時(shí)辰”醇提液2mL，右側(cè)涂等量的基質(zhì)作為對(duì)照，醫(yī)用紗布固定，連續(xù)涂抹7d。

2.2.2 觀察指標(biāo)[4-5]末次給藥次日，用溫水把殘留的受試藥物輕輕搽洗去除，觀察涂抹部位在去除受試物后的1、24、48、72h有無紅斑和水腫等反應(yīng)情況。再連續(xù)觀察1周。根據(jù)皮膚刺激反應(yīng)紅斑和水腫分別評(píng)分，最高總分值為8分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無紅斑、水腫；1分，勉強(qiáng)可見輕度紅斑、水腫；2分，明顯可見中度紅斑、水腫；3分，重度紅斑、水腫（皮膚隆起約1mm，輪廓清晰）；4分，紫紅色紅斑并有焦痂形成（皮膚隆起約1mm以上并有擴(kuò)大，嚴(yán)重水腫）。根據(jù)皮膚刺激評(píng)分來計(jì)算刺激性指數(shù)，刺激性指數(shù)平均值=（刺激反應(yīng)分值／動(dòng)物總數(shù)），皮膚刺激性強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：無刺激性，刺激性指數(shù)平均值為0～0.49；輕度刺激性，刺激性指數(shù)平均值為0.50～2.99；中度刺激性，刺激性指數(shù)平均值為3.00～5.99；重度刺激性，刺激性指數(shù)平均值為6.00～8.00。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)高劑量組、低劑量組的完整皮膚和破損皮膚進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)，根據(jù)皮膚刺激反應(yīng)紅斑和水腫評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以及皮膚刺激性強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，見表2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，高低劑量組家兔完整皮膚和破損皮膚末次給藥24h后，在觀察期內(nèi)均未見紅斑和水腫情況，也未觀察到出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況。故認(rèn)為“十二時(shí)辰”無明顯皮膚刺激性。

表2 “十二時(shí)辰”家兔皮膚刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果（分）

2.3 “十二時(shí)辰”皮膚用藥過敏實(shí)驗(yàn)

2.3.1 分組與給藥 將豚鼠按體重性別隨機(jī)分成四組，每組10只，雌雄各半，即“十二時(shí)辰”高劑量組（1.0g/mL原藥材）、“十二時(shí)辰”低劑量組（0.5g/mL原藥材）、空白對(duì)照組（基質(zhì)）、陽(yáng)性對(duì)照組（2，4-二硝基氯代苯，1%致敏濃度，0.1%激發(fā)濃度，臨用時(shí)用丙酮配置）。豚鼠于給藥前24h先用電推剪在兩側(cè)背部脫毛，再用詩(shī)妃脫毛膏脫毛，每側(cè)脫毛區(qū)面積約3cm×3cm。致敏接觸：取受試物0.2mL/只均勻涂在動(dòng)物左側(cè)脫毛區(qū)，用適宜方法固定，先覆以聚乙烯薄膜，防止液體揮發(fā)，持續(xù)6h。第7、14天，按上述方法各重復(fù)一次?？瞻谆|(zhì)對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組方法同上。激發(fā)接觸：于末次給受試物致敏后14d，將受試物0.1mL/只涂于豚鼠背部右側(cè)脫毛區(qū)，6h后去掉受試物。用溫水或無刺激性溶劑去除殘留受試物，即可觀察，然后于24、48、72h再次觀察皮膚過敏反應(yīng)情況，空白基質(zhì)對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組方法同上。

2.3.2 觀察指標(biāo)[4-5]實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照皮膚過敏反應(yīng)紅斑和水腫分別評(píng)分，最高總分值為8分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無紅斑、水腫；1分，勉強(qiáng)可見輕度紅斑、水腫；2分，明顯可見中度紅斑、水腫；3分，重度紅斑、水腫（皮膚隆起約1mm，輪廓清晰）；4分，紫紅色紅斑并有焦痂形成（皮膚隆起約1mm以上或有水皰或破潰）。記錄各時(shí)間皮膚過敏反應(yīng)平均分值，平均反應(yīng)值=（紅斑形成總分+水腫形成總分）/動(dòng)物總數(shù)。根據(jù)出現(xiàn)過敏反應(yīng)的動(dòng)物例數(shù)來計(jì)算致敏率并判斷致敏強(qiáng)度，致敏性評(píng)強(qiáng)度價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 皮膚致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 按照皮膚過敏反應(yīng)紅斑和水腫評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組的皮膚過敏反應(yīng)結(jié)果見表4。根據(jù)皮膚致敏強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)，各組的皮膚過敏反應(yīng)致敏率及致敏強(qiáng)度結(jié)果見表5。由上表結(jié)果可見，“十二時(shí)辰”高、低劑量組及空白對(duì)照組，在去掉受試藥后即刻以及24、48、72h觀察期內(nèi)，豚鼠皮膚均未出現(xiàn)紅斑和水腫，也未觀察到其他過敏反應(yīng)。根據(jù)給藥組與對(duì)照組豚鼠皮膚反應(yīng)以及致敏率情況結(jié)果分析，可認(rèn)為“十二時(shí)辰”為無致敏性藥物。

表4 “十二時(shí)辰”皮膚過敏反應(yīng)評(píng)分

表5 “十二時(shí)辰”皮膚過敏反應(yīng)致敏率及致敏強(qiáng)度

3 討論

畬藥“十二時(shí)辰”來源于毛茛科植物重瓣鐵線蓮的干燥根。其同屬植物習(xí)用品包括多種植物如威靈仙、東北鐵線蓮等，對(duì)其毒性研究已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，亦有豐富的臨床報(bào)道[6-9]。本研究前期用“十二時(shí)辰”水煎液小鼠灌胃進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其有一定的毒性反應(yīng)[3]。本研究結(jié)果表明，畬藥“十二時(shí)辰”醇提液皮膚用藥無急性毒性作用。在此基礎(chǔ)上，本研究又對(duì)其醇提液進(jìn)行小鼠灌胃急性毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其醇提液經(jīng)內(nèi)服后，也有一定的毒性作用，其毒性比水煎劑要大一些。根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該藥材雖屬低毒藥材。但不管是水煎劑還是泡酒制品，都不宜長(zhǎng)期過量服用。

目前對(duì)于畬藥“十二時(shí)辰”的研究還不夠深入，也不夠全面，還處在初級(jí)階段，主要還是集中在畬藥“十二時(shí)辰”的生藥學(xué)鑒別[10]和生藥鑒定[11]以及其揮發(fā)油的分析[12]，還有就是從園藝觀賞價(jià)值方面展開，作為觀賞花卉，有玫瑰紅、粉紅、紫色、綠色和白色等花色。在園林和栽培技術(shù)研究方面也有許多報(bào)道[13-15]。畬藥“十二時(shí)辰”的藥理作用如何，其在活血止痛、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕方面的功效如何？還需要繼續(xù)驗(yàn)證，也是今后進(jìn)一步研究開發(fā)的方向。

對(duì)畬藥“十二時(shí)辰”進(jìn)行成分、藥理、藥效、毒理等進(jìn)行全面的分析研究，既是挖掘整理、開發(fā)利用民族民間醫(yī)藥的需要，也是促進(jìn)閩東北地區(qū)少數(shù)民族鄉(xiāng)村經(jīng)濟(jì)建設(shè)的需要，對(duì)人民健康、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和地方社會(huì)進(jìn)步有著較大的意義。