孫石柱 王璐璐 姚立杰 張善強(qiáng) 王 冠 李永濤 劉丹陽(yáng) 沈 雷

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

糖尿病及其并發(fā)癥已經(jīng)成為影響社會(huì)發(fā)展進(jìn)步的重要慢性疾病[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）適合糖尿病等造成的多種組織損傷的修復(fù)，是公認(rèn)的細(xì)胞治療領(lǐng)域首選細(xì)胞[2]。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖環(huán)境導(dǎo)致MSCs活性降低[3]。脂肪中存在的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AdMSCs）具有容易獲取等特征[4]。如果在高糖環(huán)境下促進(jìn)hAdMSCs增殖或遷移能力的提高，將有利于hAdMSCs在再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。

B淋巴細(xì)胞化學(xué)引誘物-1（B-lymphocyte chemical attractants-1，BCA-1）對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很好的促進(jìn)增殖作用，還具有抗免疫、招募腫瘤細(xì)胞歸巢的效果[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有很低的免疫原性，并能逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視[6]，BCA-1可能對(duì)MSCs也發(fā)揮逃避免疫的作用。研究發(fā)現(xiàn)BCA-1可以促進(jìn)MSCs分化為成骨細(xì)胞[7]，說(shuō)明MSCs表面有BCA-1的相應(yīng)受體。雖然缺氧環(huán)境下BCA-1能夠促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖或自噬[8]，但是在高糖環(huán)境下的相關(guān)研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞高糖模型下，觀察BCA-1刺激的hAdMSCs增殖和遷移的情況，并揭示其作用的分子機(jī)制，為hAdMSCs在組織工程或再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（廣州賽業(yè)生物科技有限公司）；人BCA-1重組蛋白和人VEGF蛋白ELISA試 劑 盒（美 國(guó)R&D公 司）；PD98059（Cell Signaling公司）；細(xì)胞增殖試劑盒（CCK8，日本同仁公司）；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國(guó)Thermo Fisher公司）；多聚甲醛、結(jié)晶紫和葡萄糖（上海生工公司）；青-鏈霉素、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、RIPA細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物科技公司）；小鼠抗人PI3K抗體、小鼠抗人MAPK抗體、小鼠抗人GAPDH抗體、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（英國(guó)Abcam公司）。Bio-Rad 550酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）；BX50型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞高糖模型 含10%FBS，1μmol/L青霉素和100U/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hAdMSCs者為hAdMSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基。hAdMSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含30mmol/L葡萄糖則為hAdMSC高糖培養(yǎng)基。以此培養(yǎng)細(xì)胞則為細(xì)胞高糖模型[9]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞高糖模型下：培養(yǎng)的hAdMSCs為高糖對(duì)照組，50μmol/L濃度BCA-1刺激hAdMSCs為高糖BCA-1組，若在hAdMSCs中預(yù)先用含100nmol/L的PD98059培養(yǎng)30min，然后再添加50μmol/L BCA-1，則為高糖Erk抑制劑組，正常環(huán)境下培養(yǎng)的hAdMSCs為正常對(duì)照組。

1.2.3 CCK8實(shí)驗(yàn) 按上述hAdMSCs分組情況，將0.9×104/孔 hAdMSCs接 種 于96孔 板，100μL的hAdMSCs高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，每孔加入10μL CCK8，37℃，5%CO2培 養(yǎng)4h，使 用Bio-Rad 550酶標(biāo)儀，在450nm波長(zhǎng)測(cè)定樣品吸光度值（absorbance value，A值）。

1.2.4 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 1×104/室hAdMSCs置于Transwell細(xì)胞小室內(nèi)，下層腔室按照實(shí)驗(yàn)分組添加不同試劑或無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)12h后，收集下室液體，800s/min離心5min，收集細(xì)胞，并計(jì)數(shù)穿過(guò)細(xì)胞小室的hAdMSCs數(shù)目（計(jì)為a）；擦 除Transwell細(xì) 胞 小 室 內(nèi)hAdMSCs，4%多聚甲醛溶液固定，0.5%結(jié)晶紫染色，Image-Pro Plus 6.0.1軟件計(jì)算hAdMSCs被結(jié)晶紫染色的細(xì)胞數(shù)目（計(jì)為b）。計(jì)算hAdMSC遷移率=[（a+b）/1×104]×100%[10]。

1.2.5 ELISA 4.5×106各組hAdMSCs，按照hAdMSC分組情況，37℃，5%CO2，以含1% FBS的hAdMSC高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集各組hAdMSCs細(xì)胞上清液，人VEGF-ELISA試劑盒檢測(cè)VEGF含量。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 按照hAdMSCs分組情況，培養(yǎng)每組5.5×106hAdMSCs，加入RIPA細(xì)胞裂解液及1mmol/L PMSF，4℃，12000r/min，離心5min；BCA法測(cè)定蛋白濃度。40μg各組蛋白樣品，100V電泳90min；300mA轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜40min；封閉液中封閉60min；添加小鼠抗人PI3K抗體（1∶550）、小鼠抗人MAPK抗體（1∶700）、小鼠抗人GAPDH抗體（1∶900）；4℃孵育12h，使用HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶350），室溫孵育60min；洗膜后，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（enhanced chemiluminescent agent，ECL）等步驟檢測(cè)蛋白表達(dá)條帶，Image-Pro Plus 6.0.1軟件分析各蛋白條帶的相對(duì)表達(dá)量[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，組間比較進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BCA-1促進(jìn)hAdMSCs增殖

高糖對(duì)照組hAdMSCs的A值是正常對(duì)照組的0.59倍；相對(duì)于高糖對(duì)照組，高糖BCA-1組hAdMSCs增殖A值升高1.52倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；高糖Erk抑制劑組hAdMSCs的A值是高糖BCA-1組的0.71倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 CCK-8法檢測(cè)BCA-1對(duì)hAdMSCs增殖的A值

2.2 BCA-1促進(jìn)hAdMSCs遷移

高糖對(duì)照組hAdMSCs遷移率是正常對(duì)照組的0.35倍；高糖BCA-1組hAdMSCs遷移率是高糖對(duì)照組的1.78倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；高糖Erk抑制劑組hAdMSCs遷移率是高糖BCA-1組0.79倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BCA-1對(duì)hAdMSCs遷移的影響

2.3 BCA-1促進(jìn)hAdMSCs中PI3K、MAPK蛋白表達(dá)

細(xì)胞高糖條件下，各組hAdMSCs的PI3K、MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量的組間比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；高糖Erk抑制劑組hAdMSCs的PI3K蛋白和MAPK相對(duì)表達(dá)量分別是BCA-1組的0.49倍和0.46倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)BCA-1對(duì)hAdMSC的PI3K、MAPK蛋白表達(dá)的影響

2.4 BCA-1促進(jìn)hAdMSCs表達(dá)VEGF蛋白

高糖對(duì)照組VEGF蛋白是正常對(duì)照組的1.87倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。高糖BCA-1組VEGF蛋白是高糖對(duì)照組的2.51倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；高糖Erk抑制劑組VEGF蛋白含量是高糖BCA-1組hAdMSCs的0.35倍，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

3 討論

脂肪組織是分布于人體比較廣泛的結(jié)締組織。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織含有多分化性能，參與組織再生修復(fù)能力的細(xì)胞為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（human adipose-derived mesenchymal stem cells，hAdMSCs）。hAdMSCs獲得比較容易，含量豐富，在骨和軟骨、心血管損傷修復(fù)等領(lǐng)域起到“種子細(xì)胞”的作用[4]。高血糖會(huì)抑制宿主細(xì)胞生物活性，導(dǎo)致MSCs等細(xì)胞出現(xiàn)低增殖、遷移能力下降、能量代謝障礙等問(wèn)題，不利于組織再生修復(fù)。如果在高糖環(huán)境下提高M(jìn)SCs增殖或歸巢等能力，將對(duì)保護(hù)MSCs，移植MSCs發(fā)揮組織再生功能形成新策略。

表1 BCA-1促進(jìn)hAdMSCs表達(dá)VEGF蛋白（±s，pg/mL，n=24）

表1 BCA-1促進(jìn)hAdMSCs表達(dá)VEGF蛋白（±s，pg/mL，n=24）

注：與正常對(duì)照組比較，##P＜0.01；與高糖對(duì)照組比較，#P＜0.01；與高糖BCA-1組比較，*P＜0.01

指標(biāo) 正常對(duì)照組 高糖對(duì)照組 高糖BCA-1組 高糖Erk抑制劑組VEGF 0.33±0.19 0.62±0.10## 1.57±0.64# 0.61±0.42*

趨化因子是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、促進(jìn)細(xì)胞歸巢能力的肽類家族[12]。B淋巴細(xì)胞化學(xué)引誘物（BCA-1）與基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1）的分子結(jié)構(gòu)類似，同屬于趨化因子家族中的CXC亞科[13]。BCA-1具有炎癥介質(zhì)作用，又稱為趨化因子13（CXCL-13），BCA-1與細(xì)胞表面趨化因子受體5（CXCR5）結(jié)合，除了對(duì)損傷組織周圍MSCs等細(xì)胞具有招募作用外，還能促進(jìn)MSCs等干細(xì)胞旁分泌VEGF等因子，在傷口愈合中有重要意義[14]。

本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，高糖對(duì)照組hAdMSCs增殖A值低于正常對(duì)照組，這是由于高濃度葡萄糖會(huì)干擾線粒體能量合成或釋放，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧等氧自由基，多余的氧自由基則會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)呼吸鏈，形成惡性循環(huán)而導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力降低[15]。添加50μmol/L的BCA-1后，hAdMSCs增殖A值升高，提示BCA-1可促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)維持細(xì)胞抗高糖性損傷具有積極意義。報(bào)道發(fā)現(xiàn)，BCA-1能 促 進(jìn)MSCs成 骨 分 化[16]，說(shuō) 明MSCs膜上有BCA-1的相應(yīng)受體。因此，本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有利用PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)觀察MSCs表面的BCA-1受體，但是通過(guò)BCA-1促進(jìn)細(xì)胞增殖能力的提高，提示BCA-1能夠結(jié)合hAdMSCs表面的相應(yīng)受體。

臨床觀察到慢性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)囊滑膜層結(jié)締組織中會(huì)顯著表達(dá)BCA-1蛋白，并發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)的BCA-1周圍，白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞集中分布，說(shuō)明BCA-1能夠招募白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫性細(xì)胞歸巢和增殖，造成局部炎癥反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，50μmol/L BCA-1均會(huì)導(dǎo)致hAdMSCs遷移率增加，隨著B(niǎo)CA-1濃度的增加，hAdMSCs遷移率逐漸升高，說(shuō)明BCA-1作用于hAdMSCs表面的受體，不僅能促進(jìn)hAdMSCs分化或增殖，更能夠招募hAdMSCs歸巢。這與乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞較快生長(zhǎng)，易造成局部形成乏氧環(huán)境。乏氧環(huán)境的腫瘤細(xì)胞分泌BCA-1不僅能發(fā)揮抑制宿主免疫監(jiān)視、逃避免疫的作用，更能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增生、遷移的研究結(jié)果相一致[18]。BCA-1抑制宿主免疫監(jiān)視，招募hAdMSCs歸巢到腫瘤組織，hAdMSCs是否受到腫瘤微環(huán)境的影響分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤干細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移[19]，還需要深入探索。

糖尿病患者的高血糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致小血管、線粒體病變，形成細(xì)胞或組織乏氧狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高糖條件下BCA-1組hAdMSCs增殖活性提高的現(xiàn)象與學(xué)者在腫瘤細(xì)胞、炎癥細(xì)胞的研究結(jié)果基本一致[19]。添加了Erk抑制劑的各組hAdMSCs增殖能力相應(yīng)降低，提示細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinases，Erk）信號(hào)通路可能在BCA-1對(duì)hAdMSCs的作用中起到一定作用。PD98059抑制了Erk蛋白后，hAdMSCs細(xì)胞增殖能力降低，同時(shí)下游MAPK蛋白表達(dá)明顯降低，這可能是由于BCA-1結(jié)合在hAdMSCs表面的CXCR5受體，激活了PI3K蛋白激酶，上調(diào)Erk激酶，再活化下游的MAPK蛋白，最后啟動(dòng)VEGF蛋白的分泌。VEGF能夠反作用于hAdMSCs，促使細(xì)胞抵抗高糖損傷，維護(hù)細(xì)胞生物活性[20]。研究表明，BCA-1能激活Erk通路，促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞移植的小鼠腫瘤模型的腫瘤體積增大，乳腺癌細(xì)胞增殖和血管新生，加速腫瘤的血管轉(zhuǎn)移[21]。本研究也不排除BCA-1可能還具有激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（NF-κB induced kinase，NIK）信號(hào)通路等作用[22]，與BCA-1有關(guān)的相關(guān)分子機(jī)制還需要借助分子生物學(xué)、動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入驗(yàn)證。

綜上所述，在高糖環(huán)境中，BCA-1結(jié)合hAdMSCs表面受體，激活細(xì)胞內(nèi)PI3K-Erk-MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)hAdMSCs旁分泌VEGF蛋白，發(fā)揮了保護(hù)hAdMSCs抗高糖損傷的效果。