谷曉嬌，沈元月

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

草莓(Fragaria×ananassa)是薔薇科(Rosaceae)特色果樹之一，其果實酸甜可口、營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛；尤其結(jié)合設(shè)施栽培，彌補了冬春季鮮果采摘淡季，經(jīng)濟效益十分顯著。由于栽培草莓是一個具有復(fù)雜基因組的八倍體物種，因此傳統(tǒng)育種方法費時費力[1-2]。二倍體森林草莓與栽培草莓具有高度的序列一致性，并且由于其基因組較小(240 Mb)，世代時間短，易于遺傳轉(zhuǎn)化，是研究草莓基因功能和遺傳改良的理想材料[3-5]。

目前研究草莓基因功能可以采用瞬時轉(zhuǎn)化或穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化進行。農(nóng)桿菌介導(dǎo)草莓果實直接注射法，已證明是瞬時基因功能鑒定快速有效的方法[6-9]。該方法雖然快速方便，但外源基因瞬時表達時間短，在鑒定基因功能上存在不足。如果進行遺傳改良或者研究關(guān)于果實成熟生長發(fā)育較為復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，需要建立穩(wěn)定遺傳體系來完成則需要建立穩(wěn)定遺傳體系來完成[10]。過去草莓常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤侵染法[11-14]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤侵染法為草莓穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化主要方法，但該方法費時費力且葉片容易褐化及轉(zhuǎn)化效率低[13-14]。鎂螯合酶H亞基 ( CHLH) 通過催化鎂卟啉的生成而參與葉綠素合成，抑制其表達轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出失綠表型，易于觀測和早期鑒定[15-17]。因此，本試驗以二倍體草莓Hawaii-4的匍匐莖的莖段為試驗材料，以FvCHLH為操縱基因，通過優(yōu)化各種轉(zhuǎn)化的條件，以建立一種有效的草莓遺傳轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)基配制

以二倍體草莓(Fragariavesca)Hawaii-4匍匐莖為材料。將二倍體草莓的匍匐莖懸空放置，避免與土接觸，防止滅菌不徹底。

共培養(yǎng)基成分：4.43 g/L MS鹽，2%蔗糖，2 mg/L噻苯隆，0.2 mg/L吲哚-3-丁酸，0.8%瓊脂。MS侵染液成分：4.43 g/L MS鹽，2%蔗糖，200 μmol/L As。篩選培養(yǎng)基成分：4.43 g/L MS鹽，2%蔗糖，2 mg/L噻苯隆，0.2 mg/L吲哚-3-丁酸，35 mg/L卡那霉素, 200 mg/L特美汀，0.8%瓊脂。生根培養(yǎng)基成分：4.43 g/L MS鹽，2%蔗糖，1 mg/L 吲哚-3-丁酸， 0.8%瓊脂。MS培養(yǎng)基(Murashige Medium, M519)購自美國Sigma-Aldrich公司。所有培養(yǎng)基在加入瓊脂之前pH調(diào)為5.8，之后高壓滅菌121 ℃ ，20 min，滅菌之后抗生素在55 ℃左右加入，每個培養(yǎng)皿倒20 mL培養(yǎng)基，組培瓶倒40 mL生根培養(yǎng)基。

1.2 RNAi載體構(gòu)建

利用 Gateway 系統(tǒng)構(gòu)建RNAi 重組質(zhì)粒。首先擴增并克隆了FvCHLH基因465-bp 的 cDNA 片段，并將其克隆到 pDONRTM221載體中，利用 Gateway LR Clonase II 酶組合技術(shù)將其克隆到pK7GWIWG2(II)RR載體中。pK7GWIWG2(II)RR載體含有DsRed報告基因和卡那霉抗性基因。

1.3 農(nóng)桿菌的培養(yǎng)與侵染液的配制

將pK7GWIWG2 (II) RR+FvCHLH轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取單菌落放入含有抗生素Rif (20 μg/mL)、Gen (50 μg/mL)、Spe (100 μg/mL) LB培養(yǎng)基, 在28 ℃、180 r/min下過夜培養(yǎng)。6 000 r/min離心5 min收集菌體，使用MS侵染液懸浮，制成農(nóng)桿菌侵染液。

1.4 轉(zhuǎn)化方法

剪取草莓的匍匐莖，先用70%乙醇消毒1 min，再用1%的次氯酸鈉消毒10 min，每隔2 min晃動1次，然后用無菌蒸餾水沖洗3次，之后將無菌的莖段用剪子橫向剪成1 cm長的小段，將小段放置在上述農(nóng)桿菌侵染液中，侵染液的OD600為0.6，0.8、1和1.2，之后真空滲透10、15、20和25 min，用無菌濾紙吸干多余的農(nóng)桿菌侵染液后，再將莖段轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下暗培養(yǎng)1、2、3 d和4 d之后再轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上。為了達到篩選效果，將未轉(zhuǎn)化的莖段培養(yǎng)在含有不同濃度的卡那霉素(25、30、35和40 mg/L)的篩選培養(yǎng)基上，以便確定最合適的抗生素篩選濃度。在轉(zhuǎn)化過程中每個培養(yǎng)皿放置20個莖段外植體，3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度為(23±1) ℃，光暗周期為16 h/8 h，光照強度30 000 lx (250 μmol·m-2·s-1)。

1.5 確定侵染最佳條件和轉(zhuǎn)化效率

在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體，每2周換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)7周后出現(xiàn)芽點，利用體視熒光顯微鏡，觀察每個試驗處理的DsRed芽點數(shù)，以確定最佳侵染條件并對侵染效率進行分析。轉(zhuǎn)化效率=DsRed+的愈傷組織/總的愈傷組織個數(shù)。

1.6 轉(zhuǎn)基因植物的再生，繼代和生根

對于FvCHLH-RNAi的轉(zhuǎn)基因芽點可以用DsRed進行初步篩選，然后將有熒光的芽點繼續(xù)放置在選擇培養(yǎng)基上單獨培養(yǎng)，直至將芽培養(yǎng)到可以切除的大小，將切下的芽放置在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，最后將植株移栽至草炭∶蛭石=2∶1的基質(zhì)中。

1.7 PCR陽性植株的鑒定

采用 CTAB 法提取FvCHLH-RNAi植株的葉片基因組DNA。以野生型植物葉片為對照。 利用 PCR 技術(shù)擴增了卡那霉素(Kan)和DsRed基因片段。所用引物序列：

Kan-F:5′-CGATAGAAGGCGATGCGCTG-3′；Kan-R:5′-CGCTTGATCCGGCTACCTG-3′，

Red-F:5′-CGCCCTTGGTCACCTTCAGCTTCAC-3′；Red-R:5′-CAATGCAGTGGGACCCACGGTTC-3′?？敲顾鼗騊CR產(chǎn)物條帶大小為400 bp。DsRed的 PCR產(chǎn)物條帶大小為964 bp。

1.8 qRT-PCR分析

使用OMEGA 公司的 Plant RNAKit 試劑盒提取FvCHLH-RNAi植物的葉片和野生型植物葉片的RNA。cDNA合成使用全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix。使用TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行熒光定量分析，Actin作為內(nèi)參基因，PCR反應(yīng)體系為Mix 5 μL，上下游引物各0.25 μL，cDNA 2 μL，去離子水2.5 μL，共10 μL。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延30 s，45個循環(huán)。熒光定量引物如下：FvCHLH-F：5′-TGGGTCCCCTGATAAC-3′，F(xiàn)vCHLH-R: 5′-CCAAATCCCACTGTCC-3′；FvACTIN-F：5′-GCCAACCGTGAGAA GATG-3′；FvACTIN-R：5′-TCCAGAGTCAAGAACAATACCAG-3′。所有樣品分析均進行3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FvCHLH-RNAi載體的驗證

挑取轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的單克隆，進行PCR擴增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖4-a)，擴增出目的條帶約為523 bp，符合重組載體的設(shè)計。

2.2 抗生素濃度的確定

通過在培養(yǎng)基上添加不同濃度的抗生素，以確定莖段外植體對卡那霉素的敏感性及其最適抗生素濃度。在沒有選擇壓力的情況下，培養(yǎng)7周后觀察到95%的莖段產(chǎn)生了芽器官(圖1-a)。當選擇壓力增加到35 mg/L卡那霉素，所有外植體的芽再生都受到抑制(圖1-b)。在本研究中，使用35 mg/L卡那霉素作為最終選擇的轉(zhuǎn)化子，以消除逃逸(圖1-c)。

a. 95%的外植體在共培養(yǎng)-培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的不定芽；b. 添加35 mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選后，完全抑制了葉片外植體不定芽的發(fā)生；c. 不同卡那霉素的濃度下外植體不定芽再生率

2.3 最佳條件和侵染效率

利用體視熒光顯微鏡，觀察每個試驗處理的DsRed芽點數(shù)確定最適侵染條件(圖2-a)。在OD600值為1時侵染效果最好(圖2-b)侵染效率可以達到10%明顯高于其他處理，真空滲透時間為20 min時侵染效率達到8%，侵染效果顯著高于其他處理(圖2-c)，暗培養(yǎng)時間為3 d時侵染效率可達到10%以上顯著高于暗培養(yǎng)時間為1 d和2 d的試驗處理，與暗培養(yǎng)時間為4 d的無顯著差異(圖2-d)。綜上所述，利用草莓匍匐莖莖段法其轉(zhuǎn)化效率可以達到8%以上(圖2-b～d)。

2.4 FvCHLH-RNAi的植株再生

草莓匍匐莖的莖段經(jīng)過7周培養(yǎng)，在篩選培養(yǎng)基上出現(xiàn)愈傷組織并出現(xiàn)芽點(圖3-a)；經(jīng)過2～3周時間愈傷組織分化(圖3-b, c)；再經(jīng)過2周時間芽慢慢分化出葉片(圖3-d)。分化出的小苗單獨移到生根培養(yǎng)基中1周，然后再移栽至土壤中,由圖可以看出轉(zhuǎn)基因植株與對照植株相比，植株呈明顯矮小、黃化的表型(圖3-e)。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

通過DsRed(圖4-b)和Kan抗性基因(圖4-c)的PCR鑒定分析，轉(zhuǎn)基因植株擴增出了964 bp的DsRed條帶(圖4-b, 泳道3)和400 bp的Kan條帶(圖4-c泳道2)，而野生型植株未能擴增出相應(yīng)條帶(圖4-b 泳道1，圖4-c泳道1)。通過對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株qRT-PCR分析表明，轉(zhuǎn)基因植株CHLH

a. 愈傷組織中有DsRed熒光的芽點；通過對不同OD值(b)、真空滲透時間(c)或暗培養(yǎng)時間(d)進行評估。在做每一個侵染因素試驗中，保持其他條件不變。對于不同的處理，小寫字母表示樣本均值之間的顯著差異(P<0.05)

a. 匍匐莖莖段生成愈傷組織；b-d. 愈傷組織增殖、分化；e. 左邊為移栽至土壤中的野生型植株，右邊為轉(zhuǎn)基因植株

a. FvCHLH-RNAi載體的瓊脂糖凝膠電泳檢測；b. DsRed 的PCR分析：泳道1為野生型植株葉片，泳道2為FvCHLH-RNAi重組載體的質(zhì)粒，泳道3為轉(zhuǎn)基因植株的葉片；c. Kan的PCR分析：泳道1為野生型植株葉片，泳道2為轉(zhuǎn)基因植株的葉片；d. 轉(zhuǎn)基因植株FvCHLH相對表達量

基因的表達量與對照相比顯著被下調(diào)(圖4-d)。這些結(jié)果在分子水平證明FvCHLH-RNAi載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化。

3 討 論

前人的草莓穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化的外植體多用葉片：將草莓葉片剪成1 cm2的小塊，然后放于農(nóng)桿菌侵染液中浸泡6～8 min，然后通過葉片產(chǎn)生愈傷組織，進而誘導(dǎo)芽進行植物再生過程[2,13,18]。這種傳統(tǒng)葉盤法葉片容易褐化，愈傷組織誘導(dǎo)不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率低。本研究利用二倍體草莓匍匐莖的無菌莖段，探討一種新型高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。為了獲得最大的轉(zhuǎn)化效率，研究并優(yōu)化了一些轉(zhuǎn)化參數(shù)，包括不同侵染液的OD值，不同的真空滲透時間，不同的暗培養(yǎng)時間(即共培養(yǎng)時間)。為了消除在轉(zhuǎn)化過程中可能獲得的大量嵌合體和逃逸物[19-20]，還進行了抗生素濃度的選擇。在此研究中，相比傳統(tǒng)葉盤法主要優(yōu)點有：草莓匍匐莖的莖段可穩(wěn)定誘導(dǎo)大量的愈傷組織，利用真空滲透侵染草莓莖段，比單純的浸泡更能使農(nóng)桿菌侵入植物組織中[21]。

另外，為了轉(zhuǎn)基因植株早期鑒定，還利用了有效簡便檢測的報告基因，如DsRed熒光基因。CHLH基因干擾后，由于葉綠素的合成受到抑制，葉片出現(xiàn)黃花現(xiàn)象，容易觀測。總之，本試驗通過優(yōu)化一系列的轉(zhuǎn)化條件，建立了一種利用匍匐莖的莖段穩(wěn)定有效的轉(zhuǎn)基因體系，為今后草莓的基因改良提供借鑒，對草莓果實發(fā)育和分子育種有一定的研究意義。