莫翱瑋，沈元月

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室/北京農(nóng)學院 植物科學技術(shù)學院，北京 102206)

草莓屬于非呼吸躍變型果實，具有生長周期短、可以連續(xù)坐果，果實供應(yīng)周期長等特點，因此是研究果實發(fā)育的理想材料。草莓不耐儲運，研究其成熟調(diào)控的生理機制具有重要的產(chǎn)業(yè)價值。

多胺(polyamines，PAs)是一類廣泛存在于原核及真核生物中的低分子量脂肪族胺[1-2]，具有一定的生物活性[3,4]。游離形式的二胺腐胺(putrescine，Put)、三胺亞精胺(spermidine，Spd)和四胺精胺(spermine，Spm)是高等植物中多胺的主要成分，參與調(diào)節(jié)植物多種生理過程，如胚胎發(fā)育、開花，果實發(fā)育和成熟衰老，也參與植物體對生物和非生物脅迫的反應(yīng)[5-9]。植物中PAs分解代謝主要在植物胺氧化酶作用下進行。目前已知的胺氧化酶包括二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase，PAO)。PAO抑制劑可以降低多胺的分解代謝，Guazatine，N3-Prenylagmatine (G3)和N,N‘-Bis(2,3- butadienyl)-l,4-butane-diamin(MDL72527)作為PAO主要抑制劑，可以抑止PAO活性的64%～75%，在研究PAO的功能方面發(fā)揮重要作用[10-11]。Agudelo-Romero等發(fā)現(xiàn)多胺分解代謝可能在葡萄果實成熟中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。Tsaniklidis等在番茄研究中發(fā)現(xiàn)，果實PAO基因在隨著果實發(fā)育階段表達量逐漸升高，特別是在紅果期，表達量遠遠高于綠果期，這表明多胺分解代謝的增強可能在果實成熟中起作用[13]。

目前，關(guān)于PAs在參與草莓果實成熟及品質(zhì)形成方面已經(jīng)取得了一些重要進展，通過操縱FaSAMDC的表達，達到抑制或加速Spd和Spm的生物合成，進而調(diào)控草莓果實的發(fā)育和成熟，該研究的主要方向是多胺合成與果實發(fā)育和成熟的關(guān)系[14]。但是，與SAMDC調(diào)控果實成熟過程Spd和Spm的生物合成相反，PAO參與的Spd和Spm降解在草莓果實中作用有待研究。

為了揭示PAO在草莓果實成熟中的作用，本研究以‘章姬’草莓為材料，使用一定濃度的PAO抑制劑對發(fā)育中草莓果實進行外源涂抹處理，研究PAO在草莓果實成熟中調(diào)控作用，為草莓果實的成熟調(diào)控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

使用北京農(nóng)學院東大地溫室栽培的‘章姬’(‘ZhangJi’)草莓品種。條件控制為：溫度17～26 ℃、相對濕度70%～90%、光照/黑暗14/10 h。選取40個草莓單株的120朵花，并對其進行花期標記。記錄在果實發(fā)育的七個時期的狀態(tài)，包括小綠果期、大綠果期、褪綠果期、白果期、始紅期、片紅期和全紅期。

1.2 試驗方法

1.2.1 草莓果實的外源抑制劑處理 參考Agudelo-Romero以及王偉[10,15]用外源PAO抑制劑處理葡萄果實和擬南芥的方法，選用濃度為100 μM的Guazatine、N3-Prenylagmatine(G3)、N,N‘-Bis(2,3- butadienyl)-l,4-butane-diamin(MDL72527)溶液，用脫脂棉簽均勻地涂抹在褪綠時期果實的表面，同時用無菌水作為對照，經(jīng)過8 d后去瘦果(種子)，切取花托(果實，0.5～0.8 cm3)并立刻液氮速凍，-80 ℃保存待用，樣本量10個果，試驗重復3次。

1.2.2 花色苷的測定 參照農(nóng)業(yè)標準NY/T 3164—2017提取花色苷，用高效液相色譜檢測，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為0.2%甲酸溶液-乙腈(98∶2)混合溶液，流動相流量為1 mL/min，色譜柱溫度為30 ℃，每個樣品進樣量為10 μL，檢測波長520 nm[16]，樣本量3個果，重復3次。

1.2.3 果實硬度的測定 草莓切去果皮，果實硬度計力度均勻插進果實讀數(shù)，樣本量3個果，重復3次。

1.2.4 可溶性糖的測定 參照國標GB 5009.8—2016處理樣品，用高效液相色譜檢測，色譜柱為Sugar-PakTM1 column (6.5 mm×300 mm, Waters)，超純水做流動相，流動相流量為0.4 mL/min，柱溫60 ℃，進樣量20 μL，檢測溫度為50 ℃，用示差折光檢測器(RID)檢測數(shù)值，樣本量3個果，試驗重復3次。

1.2.5 多胺含量的測定 參照GB/T 21970—2008進行樣品的配制及多胺衍生，用高效液相色譜檢測，色譜柱為ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 um)，柱溫30 ℃，流動相為甲醇-水(64∶36)，流速0.7 mL/min，檢測波長230 nm，進樣量為10 μL，樣本量3個果，試驗重復3次。

1.2.6 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 RNA提取參照OMEGA R6827-01 試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄cDNA按照北京全式金生物公司TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書。

1.2.7 熒光定量(qRT-PCR)分析基因表達量 熒光定量PCR反應(yīng)體系參照北京全式金公司TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明，PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延30 s，45個循環(huán)。草莓FaPAO5基因和內(nèi)參基因Actin[17]熒光定量引物如下：FaPAO5-F：5′-GTGCTACTTCAACTTCTTC-3′，F(xiàn)aPAO5-R：5′-CTAAACCCCAACATGGTGG-3′；FaAC TIN-F：5′-GCCAACCGTGAGAAGAT-3′，F(xiàn)aACTIN-R：5′-TCCAGAGTCAAGAACA-3′。實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler 96，瑞士)上機結(jié)束后，通過LC96軟件分析試驗數(shù)據(jù)，試驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓果實的發(fā)育過程

‘章姬’(‘ZhangJi’)草莓從花后到成熟需要近30 d，在17 d左右果實發(fā)育至褪綠時期，褪綠后的果實開始軟化并著色，之后果實體積快速增大并快速著色(圖1)。

2.2 PAO抑制劑處理對草莓成熟的影響

如圖2所示，8 d后，觀察果實表型，并統(tǒng)計各處理下深紅色、紅色和淺紅色果實的比例。結(jié)果表明，試驗組主要為深紅色，而對照組果實主要為淺紅色。與對照組相比，抑制劑處理后果實的多胺氧化酶基因(FaPAO5)表達量顯著降低、花色苷含量增加、可溶性糖含量上升、果實硬度降低及 Put含量降低，Spm和Spd含量升高。以上結(jié)果表明，多胺氧化酶PAO在草莓果實成熟中發(fā)揮著重要作用。

(A)抑制劑處理表型；(B)不同處理后果實顏色統(tǒng)計；數(shù)據(jù)使用Duncan檢測法進行方差分析，*表示統(tǒng)計學顯著性差異(P <0.05)

3 討 論

草莓被認為是研究非呼吸躍變型果實發(fā)育的模式植物材料，并且草莓果實成熟及品質(zhì)形成過程中伴隨著多胺的合成與分解，果實硬度改變，可溶性固形物的不斷積累，可溶性糖(葡萄糖、果糖及蔗糖)及花色苷積累等復雜變化[18]。通過外施多胺氧化酶抑制劑Guazatine、G3、MDL72527處理草莓果實，發(fā)現(xiàn)果實FaPAO5基因表達量下降，對應(yīng)果實的硬度降低，可溶性糖、花色苷含量升高，因此初步推斷PAO參與草莓果實的成熟。

多胺廣泛存在于植物體內(nèi)，對提高植物抗逆性，調(diào)控植物發(fā)育、果實發(fā)育與成熟起著十分重要的作用，而PAO可以氧化分解多胺產(chǎn)生H2O2和1,3-二氨基丙烷(1,3-diaminopropane，Dap)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，對維持植物體內(nèi)多胺水平至關(guān)重要[19-20]。通過抑制PAO活性，多胺氧化酶可能作為一種阻遏蛋白，抑制FaPAO5基因表達，致使基因表達量下降，達到負調(diào)控目的。而果實內(nèi)Put含量降低，Spd和Spm卻上升，因此推測多胺氧化酶參與了多胺的末端分解代謝。Put降低可能是果實內(nèi)Spd和Spm分解減緩，而 Put 作為Spd和Spm 上游合成底物其含量也會相應(yīng)減少。Spd和Spm含量增加，與之前試驗中，多胺合成途徑的關(guān)鍵酶S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(SAMDC)調(diào)控果實內(nèi)Spd 和 Spm量，達到參與調(diào)控草莓果實的成熟結(jié)果相一致[14]，最終推測多胺氧化酶通過調(diào)節(jié)草莓果實內(nèi)多胺水平(主要是Spd和Spm水平)參與調(diào)控草莓果實的成熟。