胡國(guó)靜，隋新月，王 瀟，劉 卉

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，山東 濟(jì)南 250014）

原發(fā)性痛經(jīng)（primary dysmenorrhoea）也稱為功能性痛經(jīng)，系指生殖器官無(wú)明顯器質(zhì)性病變的痛經(jīng)。表現(xiàn)為經(jīng)期及其前后周期性小腹疼痛，且常伴有惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響正常生活。有研究證明其跟月經(jīng)期子宮內(nèi)膜釋放前列腺素（PG）有關(guān)[1-3]，中草藥可能通過(guò)抑制PG的合成發(fā)揮外周鎮(zhèn)痛作用和抗炎作用[4]。

失笑散出自宋代《太平惠民和劑局方》，全方僅有五靈脂、蒲黃2味藥且用量相等，而且炮制方式特殊，其中蒲黃炒香、五靈脂酒研，淘去砂土各等分為末[5]，是臨床治療血瘀作痛的常用方?！豆沤衩t(yī)方論》“失笑”者，忍俊不住而發(fā)笑。此方雖僅有2味平常之藥，卻能有效緩解瘀血疼痛，效果之佳使人忍不住發(fā)出笑聲，故稱之為“失笑散”。由于中藥復(fù)方治療疾病通過(guò)多途徑發(fā)揮作用，導(dǎo)致其作用機(jī)制不夠明確。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點(diǎn)符合中醫(yī)的基本特征，可以揭示中藥的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用，為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理搭建了良好的平臺(tái)[6]。故本研究旨在通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探尋失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用靶點(diǎn)，初步探究相關(guān)生物過(guò)程及作用通路，說(shuō)明其作用機(jī)制，以便為進(jìn)一步的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 失笑散有效化合物及作用靶點(diǎn)、相應(yīng)基因的檢索與篩選 通過(guò)TCMSP（中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蒲黃的活性成分，再根據(jù)生物利用度（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18）、半衰期（HL≥4 h）進(jìn)行篩選，找到治療原發(fā)性痛經(jīng)的有效成分。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索蒲黃（Pollen Typhae）每個(gè)有效化合物對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)信息，并除去沒(méi)有靶點(diǎn)及重合的部分。通過(guò)BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索五靈脂（Faeces Trogopterpri）的有效化合物及作用靶點(diǎn)，設(shè)置Score cutoff≥30和P≤0.05進(jìn)行篩選。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中的UniProtKB搜索功能，將物種設(shè)定為“人”，將所得到的靶點(diǎn)進(jìn)行名稱轉(zhuǎn)化，利于進(jìn)一步與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配。最后整理出失笑散的有效化合物及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 構(gòu)建失笑散“藥物—化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖 將整理好的失笑散有效成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)上傳至Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建失笑散“藥物—化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，由此分析得出失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)的主要有效化合物。

1.3 疾病靶點(diǎn)的檢索及其與藥物靶點(diǎn)的匹配 以“primary dysmenorrhea”為關(guān)鍵詞，運(yùn)用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org）獲取疾病的相關(guān)靶點(diǎn)與基因，將結(jié)果導(dǎo)入Excel表中去重備用。利用VENNY 圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將失笑散有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，得到失笑散與原發(fā)性痛經(jīng)的共同靶點(diǎn)，將共同靶點(diǎn)整理到Excel表中備用。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 將疾病與藥物的共同靶點(diǎn)上傳至 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），將物種設(shè)置為“人”，以獲取蛋白之間的相互作用關(guān)系，下載結(jié)果中的TSV格式文檔，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件繪制關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)degree值找出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因功能及作用通路分析 將疾病與藥物的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至 David數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp），對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，將閾值設(shè)定為P<0.05，篩選排名靠前的生物過(guò)程和通路。

2 結(jié)果

2.1 五靈脂、蒲黃的有效化合物及相關(guān)靶點(diǎn) 通過(guò)TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)定 OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h的標(biāo)準(zhǔn)值，分別篩選出蒲黃及五靈脂的化學(xué)成分，除去無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)者共篩選出12個(gè)有效化合物，其中蒲黃6個(gè)，五靈脂6個(gè)，見(jiàn)表1。再借助 TCMSP、Uniprot、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)去重和篩選共得到五靈脂、蒲黃的作用靶點(diǎn)293個(gè)，整理到Excel表中備用。

表1 失笑散中候選化合物相關(guān)信息

2.2 失笑散“藥物—化合物—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將整理好的失笑散有效化合物及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)上傳到Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建失笑散“藥物—化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。其中黃色圓形代表蒲黃和五靈脂，粉紅色六邊形代表蒲黃的6種化合物（PH1～PH6 分別為 （2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one、花生四烯酸、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素），綠色六邊形代表五靈脂的6種化合物（WLZ1～WLZ6分別為ponalactone A、尿素、尿酸、五靈脂酸、續(xù)斷皂苷E1、三羥基異膽固醇酸），藍(lán)色菱形代表靶點(diǎn)基因信息，其中degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大，根據(jù)degree值排名前4的化合物為槲皮素、山奈酚、花生四烯酸、三羥基異膽固醇酸，說(shuō)明這幾個(gè)化合物是發(fā)揮作用的關(guān)鍵活性成分。

2.3 原發(fā)性痛經(jīng)相關(guān)靶點(diǎn)的篩選及與失笑散靶點(diǎn)的匹配 運(yùn)用Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取原發(fā)性痛經(jīng)的相關(guān)靶點(diǎn)，去重后共得到205個(gè)，導(dǎo)入到Excel表里備用。利用VENNY圖將失笑散有效成分的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到共有靶點(diǎn)43個(gè)，分別為PTGS1、ESR1、 PTGS2、 PGR、 CASP3、 PPARG、 NOS3、ALOX5、PLA2G4A、PTEN、ESR2、PPARD、XDH、ADRB2、OPRM1、BAX、TGFB1、TNF、CYP3A4、CYP1A1、GSTP1、GSTM1、VEGFA、FOS、CDKN1A、MMP2、MMP9、IL6、TP53、NFKBIA、ERBB2、CAV1、IL1B、CCL2、CXCL8、PPARA、CRP、IGFBP3、IGF2、WNT4、AVPR1A、GHRL、TRPV1，見(jiàn)圖 2。

2.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò) 將疾病與藥物的共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1繪制關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。此網(wǎng)絡(luò)圖共包括關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)37個(gè)（已除去關(guān)聯(lián)度低且于最核心靶蛋白無(wú)關(guān)的節(jié)點(diǎn)），degree越大，其節(jié)點(diǎn)越大，表明與其他蛋白的相互作用越強(qiáng)。失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)的靶標(biāo)中degree值排名前10的為IL-6、TNF、PTGS2、TP53、VEGFA、CASP3、CXCL8、FOS、NOS3、IL-1B，其相關(guān)degree數(shù)值見(jiàn)表2，說(shuō)明這10個(gè)蛋白可能是治療原發(fā)性痛經(jīng)的關(guān)鍵靶蛋白。

2.5 GO基因功能富集分析 將10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)上傳至David數(shù)據(jù)庫(kù)，GO富集主要涉及98個(gè)生物過(guò)程，8個(gè)細(xì)胞組成和8個(gè)分子功能。將生物過(guò)程、細(xì)胞組成、分子功能按P值大小進(jìn)行排序，P值越小表明富集程度越高。GO富集分析的生物學(xué)過(guò)程排名前20的條目見(jiàn)表3。結(jié)果表明6個(gè)靶點(diǎn)參與了炎癥應(yīng)答，6個(gè)靶點(diǎn)參與了RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，4個(gè)靶點(diǎn)參與了NO生物合成過(guò)程的正調(diào)節(jié)，4個(gè)靶點(diǎn)參與了凋亡過(guò)程的正調(diào)節(jié)，3個(gè)靶點(diǎn)參與了IL-6產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)，3個(gè)靶點(diǎn)參與了NF-κB向核內(nèi)輸入的正調(diào)節(jié)，3個(gè)靶點(diǎn)參與了細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)，3個(gè)靶點(diǎn)參與了肽基絲氨酸磷酸化的正調(diào)節(jié)等，由此可知失笑散可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程治療原發(fā)性痛經(jīng)。

圖1 失笑散“藥物—化合物—靶點(diǎn)”的可視化網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 失笑散與原發(fā)性痛經(jīng)交集靶點(diǎn)基因WENNY圖

表2 失笑散作用于原發(fā)性痛經(jīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖3 關(guān)鍵靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路分析主要涉及50條通路，根據(jù)P值進(jìn)行排序，其中排名前20的信號(hào)通路見(jiàn)表4，包括TNF、Toll樣受體、癌癥通路、NOD樣受體、NF-κB、MAPK信號(hào)通路等，提示失笑散通過(guò)多通路多靶點(diǎn)來(lái)治療原發(fā)性痛經(jīng)，且各通路之間存在相互聯(lián)系。

表3 GO富集功能分析結(jié)果

3 討論

痛經(jīng)分為原發(fā)性痛經(jīng)和繼發(fā)性痛經(jīng)兩種類型。繼發(fā)性痛經(jīng)一般有盆腔臟器的器質(zhì)性病變，包括子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌病等，而原發(fā)性痛經(jīng)則無(wú)上述表現(xiàn)。原發(fā)性痛經(jīng)青少年期常見(jiàn)，多在初潮后6～12個(gè)月發(fā)病。據(jù)國(guó)內(nèi)抽樣調(diào)查顯示，中國(guó)女性痛經(jīng)發(fā)生率為33.1%，其中原發(fā)性者占53.2%，痛經(jīng)嚴(yán)重影響工作者占13.53%[7]，可見(jiàn)原發(fā)性痛經(jīng)帶來(lái)的痛苦不容小覷，對(duì)其治療方法的研究具有很好的臨床價(jià)值。中醫(yī)學(xué)中痛經(jīng)又稱經(jīng)行腹痛，痛經(jīng)一詞最早見(jiàn)于漢代張仲景《金匱要略·婦人雜病脈證并治》“帶下，經(jīng)水不利，少腹?jié)M痛，經(jīng)一月再見(jiàn)”[8]。痛經(jīng)的病因病機(jī)分為虛實(shí)兩種，實(shí)者不通則痛，虛者不榮則痛，歷代醫(yī)家多將其分為寒凝血瘀、氣滯血瘀、氣血虛弱、陽(yáng)虛內(nèi)寒、肝腎虛損等證型[3]。楊愛(ài)萍等[9]通過(guò)對(duì)大量文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性痛經(jīng)患者中屬血瘀者最常見(jiàn)占83.2%。這為臨床治療原發(fā)性痛經(jīng)提供了活血化瘀的治療思路。

失笑散出自宋代《太平惠民和劑局方》“治婦女產(chǎn)后心腹痛欲死，百藥不解，服此頓愈”。失笑散作為治療血瘀作痛常用方，在治療瘀血阻滯型冠心病、胃脘痛、病毒性肝炎、計(jì)劃生育、不孕癥、宮外孕、原發(fā)性痛經(jīng)等方面具有良好療效[7，10]，這也證實(shí)了中醫(yī)異病同治的思想?！侗静菥V目》記載：蒲黃，手足厥陰血分藥也，故能治血治痛。生則能行，熟則能止。與五靈脂同用能治一切心腹諸痛?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蒲黃的乙醇提取液有明顯的鎮(zhèn)痛作用[11]，五靈脂可以通過(guò)細(xì)胞毒、抗炎、活血化瘀等作用治療軟組織損傷、消化性潰瘍、疼痛等，且五靈脂與其他中藥配伍治療原發(fā)性痛經(jīng)效果好，標(biāo)本兼治[12]。失笑散對(duì)改善子宮動(dòng)脈血流，改善血瘀型原發(fā)性痛經(jīng)癥狀有療效明顯[13]，而活血化瘀藥物具有改善平滑肌痙攣、消炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等作用[14]?？梢?jiàn)失笑散可以通過(guò)活血化瘀、抗炎鎮(zhèn)痛等途徑以達(dá)到對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的治療目的。雖然目前對(duì)五靈脂、蒲黃的藥理學(xué)作用已經(jīng)有了基本了解，但對(duì)其治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用通路等研究少見(jiàn)，故本文就此方面做了相應(yīng)研究。

表4 KEGG通路富集分析結(jié)果

本次研究發(fā)現(xiàn)失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)的關(guān)鍵活性成分為槲皮素、山奈酚等。槲皮素是失笑散中對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)最多的成分，具有較強(qiáng)抗炎能力的長(zhǎng)效抗炎物質(zhì)[15]，而山奈酚可以通過(guò)下調(diào)IL-6表達(dá)，上調(diào)TNF表達(dá)作用于炎癥反應(yīng)[16]。這二者都能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)起治療作用。

失笑散主要通過(guò) IL-6、TNF-α、PTGS2（前列腺素G/H合酶2）作用于原發(fā)性痛經(jīng)。原發(fā)性痛經(jīng)的病理生理學(xué)主要與PG水平升高有關(guān)[17-18]，且IL-6、TNF-α等炎性因子也可以通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)引起子宮平滑肌缺血缺氧導(dǎo)致疼痛的產(chǎn)生。TNF-α是一種重要的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、腫瘤免疫、低氧及血脂異常等多種生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用[19]。由此可知失笑散可通過(guò)上調(diào)TNF-α表達(dá)以及下調(diào)IL-6、PTGS2表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過(guò)程及抑制前列腺素合成，起到治療原發(fā)性痛經(jīng)的作用。

根據(jù)GO富集分析顯示，失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)的主要作用機(jī)制為細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、肽基絲氨酸磷酸化的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、NF-κB向核內(nèi)輸入的正調(diào)節(jié)。Kannan Priya等[18]認(rèn)為前列腺素水平異常導(dǎo)致頻繁/節(jié)律紊亂的子宮收縮，進(jìn)而導(dǎo)致缺血和缺氧，引發(fā)痛經(jīng)。鐘華青[17]認(rèn)為IL-6、TNF-α等炎性因子也可引起子宮平滑肌缺血缺氧。禹龍香[20]認(rèn)為通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)磷酸化可以加強(qiáng)鈣離子結(jié)合，從而抑制子宮平滑肌收縮，緩解疼痛。周宇博等[21]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與痛經(jīng)密切相關(guān)。

KEGG通路富集分析主要涉及腫瘤壞死因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。失笑散可以作用于腫瘤壞死因子信號(hào)通路，調(diào)控TNF-α表達(dá)，緩解炎癥反應(yīng)，減輕血管內(nèi)皮損傷[22]，有利于原發(fā)性痛經(jīng)的好轉(zhuǎn)。同樣又可以作用于NOD樣受體信號(hào)通路，通過(guò)抑制pracspase-1和pro-IL-1β的激活過(guò)程、抑制NF-κB信號(hào)等途徑來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[23]。而NOD1可作為TNF通路的一個(gè)增敏劑[24-25]，也就是說(shuō)TNF、NOD樣受體信號(hào)通路及NF-κB信號(hào)通路之間有一定聯(lián)系，三者都與炎癥反應(yīng)有關(guān)。原發(fā)性痛經(jīng)作為炎癥反應(yīng)過(guò)程，其發(fā)生發(fā)展與參與炎癥反應(yīng)過(guò)程的各種遞質(zhì)有關(guān)[22]。KEGG富集結(jié)果表明失笑散可以通過(guò)多通路對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)起到治療作用，主要涉及TNF、NOD樣受體、NF-κB等炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。

綜上所述，失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)是通過(guò)多靶點(diǎn)多通路發(fā)揮作用的，通過(guò)對(duì)主要靶點(diǎn)IL-6、TNF、PTGS2的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)以及作用于細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、肽基絲氨酸磷酸化的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、NF-κB向核內(nèi)輸入的正調(diào)節(jié)等生物過(guò)程，最終作用于炎癥相關(guān)通路（TNF、NOD 樣受體、NF-κB 信號(hào)通路），從而抑制前列腺素的合成及相關(guān)的炎性反應(yīng)，減少子宮異常收縮帶來(lái)的缺血缺氧、緩解疼痛，達(dá)到對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)的治療目的。本研究仍有很多不足，比如有些化合物的分子式、分子量未找到，但仍希望能為失笑散治療原發(fā)性痛經(jīng)提供基礎(chǔ)的生物信息學(xué)支撐。