張淑霞， 田亞， 邢榮花，劉勝男， 王向軍*， 張守杰

1(鄭州海關(guān)技術(shù)中心，河南 鄭州，450002)2(安陽海關(guān)，河南 安陽，455000)3(三門峽海關(guān)技術(shù)中心，河南 三門峽，472000)

近年來，植物蛋白飲料已成為飲料市場(chǎng)的主流產(chǎn)品，越來越受消費(fèi)者喜愛[1-2],隨著消費(fèi)人群的快速增長(zhǎng)，不法商販為了追求經(jīng)濟(jì)利益，以次充好，摻雜摻假，如在核桃、杏仁露飲品中摻入價(jià)格較為低廉的大豆、花生成分[3]，這種商業(yè)欺詐行為不僅擾亂市場(chǎng)秩序，還侵犯了消費(fèi)者的合法權(quán)益。因此，建立準(zhǔn)確、可靠的植物蛋白飲料摻假的鑒定方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，植物蛋白飲料的摻假鑒別方法主要有酶聯(lián)免疫分析(enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。其中，ELISA技術(shù)的抗原抗體具有專一性，無法同時(shí)檢測(cè)幾種特異物種，且熱加工工藝易導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀和抗原決定簇的破壞，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[4-5]；PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物同時(shí)檢測(cè)，是目前鑒定食品摻假成分的常用方法[6-9]，但是其檢測(cè)物DNA在高度加工過程中容易降解，且存在非特異性擴(kuò)增引起DNA污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的基質(zhì)干擾問題[10-12]；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)主要檢測(cè)蛋白質(zhì)或不同物種的特征多肽，穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高，可以實(shí)現(xiàn)多物種的同時(shí)測(cè)定，并且能夠避免復(fù)雜基質(zhì)干擾及假陽性判別的問題。

隨著靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的物種特征肽段檢測(cè)已逐漸成為食品摻假鑒別和外源性成分鑒定的主要方法[13-15]。古淑青等[16]采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，鑒別出了羊肉、鴨肉、雞肉和豬肉4種肉類的生物標(biāo)志性肽段，并建立了羊肉中摻入鴨肉、雞肉和豬肉的定量檢測(cè)方法。B?NICK等[17]利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)面包中的小麥、斯佩耳特小麥和黑麥的真實(shí)性進(jìn)行了檢測(cè)。GU等[18]利用基于特征肽段的液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),測(cè)定了巧克力中大豆、花生、杏仁、核桃、榛子等過敏源成分的含量。但是基于特征肽段的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定量測(cè)定核桃露和杏仁露中大豆、花生成分的研究還未見報(bào)道。

本文主要采用高效液相色譜-四級(jí)桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(high performance liquid chromatography coupled with quadrupole-exacti e mass spectrometr,HPLC-Q/Exactice-MS)和高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜(high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole tandem mass spectrometry,HPLC-QQQ-MS)相結(jié)合，篩選出核桃、杏仁、大豆和花生的特征肽段，并建立以特征肽段為檢測(cè)對(duì)象的核桃露和杏仁露摻假鑒別測(cè)定方法，為打擊植物蛋白飲料摻假行為、保證食品安全，提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(HPLC-Q-Exacti e配Ultimate 3000液相色譜)、酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(Agilent 6470A配Agilent 1290 Infinity Ⅱ液相色譜)，美國(guó)Agilent公司；5427 R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；高溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CF15RXII離心機(jī)，日本Hitachi公司；Y905制漿機(jī)，九陽股份有限公司；XS205天平，瑞士Mettler-Toledo公司；10 kDa超濾離心管，德國(guó)賽多利斯公司。

1.2 試劑與材料

測(cè)序級(jí)胰蛋白酶、二硫代蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)，生化級(jí)，美國(guó)Promega公司；碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)，生化級(jí)，美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲酸、乙酸,均為色譜純,美國(guó)Thermo Fishe公司；Brad-ford蛋白定量試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；NH4HCO3、尿素為分析純；所有實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備，美國(guó)Millipore公司。

核桃、杏仁、大豆、花生均購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，4個(gè)品牌共6個(gè)批次的核桃露、杏仁露和核桃杏仁露樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)卮笮统小：颂衣?、杏仁露樣品制備：稱取去殼核桃仁、杏仁各7.000 g，加入240 mL 95 ℃熱水，用打漿機(jī)將其打碎，過200目篩，均質(zhì)，殺菌備用?；旌瞎稑悠分苽?按以上制漿方法制備核桃大豆露、核桃花生露、杏仁大豆露及杏仁花生露，以核桃大豆露為例，大豆質(zhì)量占堅(jiān)果總質(zhì)量(7.000 g)的10%、30%和50%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取

稱取10 g樣品，加入30 mL預(yù)冷乙腈混勻，于-20 ℃放置2 h,10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，向沉淀中加入5 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3),垂直振蕩30 min，溶解蛋白沉淀，10 000 r/min離心5 min, 上清液通過0.22 μm聚醚砜濾膜，一式3份，用Bradford試劑盒測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度。

對(duì)照樣品核桃、杏仁、大豆、花生于40 ℃鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥24 h，用粉碎機(jī)進(jìn)行細(xì)粉碎。稱取1 g粉粹樣品加入10 mL正己烷振蕩3 min，10 000 r/min離心3 min，棄去上清液，重復(fù)1次，去除脂肪。加入10 mL蛋白提取液(8 mol/L尿素，50 mmol/L NH4HCO3)，步驟同上。

1.3.2 蛋白質(zhì)酶解

取200 μL上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入2 μL 1 mol/L的DTT溶液，60 ℃下反應(yīng)1 h，冷卻至室溫后加入10 μL 1 mol/L的IAA溶液，常溫下避光反應(yīng)30 min。采用10 kDa超濾離心管在13 200 r/min下離心超濾15 min，并用200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液置換3次，棄去下層溶液，加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液復(fù)溶膜上層蛋白，按酶和底物質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶溶液混勻，于37 ℃酶解16 h，加入2 μL甲酸終止反應(yīng)，13 200 r/min離心10 min，下層獲得蛋白多肽樣品溶液，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 HPLC-Q/Exacti e-MS條件

色譜條件：PAK C18 MGIII色譜柱(2.0 mm×150 mm，3 μm)；柱溫45 ℃；流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-水溶液；流動(dòng)相B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，10% B；1～17 min，10% B～35% B；17～19 min，35% B～90% B；19～21 min，90% B～10% B；21～25.5 min，10% B。流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL。

質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 500 ；毛細(xì)管溫度320 ℃；離子源加熱溫度250 ℃；鞘氣流量30 Arb，輔助氣流量10 Arb；質(zhì)譜掃描模式Full MS-ddMS2(TopN)；全掃描分辨率70 000 FWHM；AGC target 3e6；進(jìn)樣時(shí)間100 ms；二級(jí)掃描分辨率 17 500 FWHM；AGC target 2e5；進(jìn)樣時(shí)間110 ms；碰撞能量30 e 。

1.3.4 HPLC-QQQ-MS條件

色譜條件：同1.3.3。

質(zhì)譜條件：ESI源，采用正離子模式；毛細(xì)管電壓4 000 ，噴嘴電壓1 000 ，干燥氣溫度350 ℃，干燥器流速9 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min，霧化器壓力30 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分辨質(zhì)譜特異肽段的篩選

特征肽段指某一個(gè)蛋白質(zhì)所特有的能夠?qū)⑵渑c其他蛋白質(zhì)特異性區(qū)分的肽段序列。特征肽段的篩選應(yīng)遵循以下原則[19-20]：以7～20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽為宜；不含錯(cuò)切或漏切的酶切位點(diǎn)；避免出現(xiàn)天冬氨酸的水解、甲硫氨酸的氧化和谷氨酰胺的脫酰胺等不穩(wěn)定肽段；選擇具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)，有響應(yīng)較強(qiáng)的碎片離子，進(jìn)行定性定量分析時(shí)，有較好的靈敏度和峰形的肽段。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-Q-Exacti e Full MS-ddMS2(TopN)模式分析胰蛋白酶酶解后的核桃、杏仁、大豆、花生多肽樣品，數(shù)據(jù)經(jīng)Proteome Disco erer軟件和Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析，通過比較這4個(gè)物種鑒定的蛋白質(zhì)和肽段列表，找到每個(gè)物種獨(dú)有的多肽信息，如表1所示。研究發(fā)現(xiàn)杏仁的GNLDF QPPR、 FSNDIL AALNTPR、大豆的EAFG NMQI R、LITLAIP NKPGR和TISSEDKPFNLR及花生的RPFYSNAPQEIFIQQGR因含有KR，KP，RP不適合做定量分析，為保證鑒定結(jié)果的重現(xiàn)性和靈敏度，在定量方法中未選擇其作為鑒定物種來源的特征肽段。

表1 核桃、杏仁、大豆和花生的特征肽段Table 1 Marker peptides of walnut, almond, soybean and peanut

二級(jí)質(zhì)譜用于鑒定特征肽段的碎片離子，用來考察特征肽段碎片離子的檢測(cè)結(jié)果與理論推測(cè)的吻合性，多肽在電噴霧電離中主要產(chǎn)生N端碎片離子(b離子)和C端碎片離子(y離子)。以花生Ara h 3/4蛋白的特征肽段TANELNLLILR(m/z628.4)為例，如圖1所示，圖中灰色和淺灰色譜線分別代表理論b離子和y離子的碎片峰，黑色譜線代表實(shí)驗(yàn)獲得的離子碎片峰，可以看出實(shí)驗(yàn)獲得的譜圖和預(yù)測(cè)的碎裂模式匹配度很高，20個(gè)b、y碎片離子均得到鑒定。

圖1 花生特征肽段TANELNLLILR(m/z 628.4)的碎片離子排布實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論對(duì)比圖Fig.1 Comparison of the experimental and theoretical prediction results for fragment ion arrangement of the precursor ion at m/z 628.4 assigned to the peanut marker peptide TANELNLLILR

2.2 三重四級(jí)桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式分析

利用Skyline軟件在HPLC-QQQ-MS平臺(tái)上構(gòu)建了特征肽段的MRM方法，優(yōu)化碰撞能量(collision energy,CE)和碎裂電壓(fragmentor)，提高各特征肽段的響應(yīng)強(qiáng)度。圖2為對(duì)大豆特征肽段LSAEFGSLR的490.3(2+)→779.4(+)離子通路施加不同fragmentor值和CE值得到的相應(yīng)強(qiáng)度，可見當(dāng)fragmentor為130 時(shí),肽段響應(yīng)強(qiáng)度最高。如此，針對(duì)每個(gè)離子對(duì)優(yōu)化出了最佳的CE值和fragmentor值，生成最終的Dynamic MRM定量方法，MRM方法中各物種特征肽段離子對(duì)信息見表2，各物種特征肽段的提取離子色譜圖見圖3。

a-不同碰撞能量對(duì)照?qǐng)D; b-不同碎裂電壓對(duì)照?qǐng)D圖2 大豆特征肽段LSAEFGSLR的碰撞能量和碎裂電壓值優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimized results of CE and fragmentor alues of soybean marker peptide LSAEFGSLR

2.3 特異肽段的驗(yàn)證

采用排除法驗(yàn)證所選肽段的特異性，以大豆為例，將核桃、杏仁、花生特征肽段的MRM方法合并形成一個(gè)新的MRM方法，用該方法檢測(cè)大豆樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4-a所示，大豆樣品采集到的色譜質(zhì)譜圖中沒有出現(xiàn)其他3個(gè)物種的特征肽段峰，出現(xiàn)個(gè)別肽段的單個(gè)離子對(duì)色譜峰的保留時(shí)間和對(duì)應(yīng)肽段不相同，非目標(biāo)肽段。采用相同方法驗(yàn)證了花生、核桃和大豆樣品，結(jié)果如圖4-b、圖4-c、圖4-d所示，未出現(xiàn)保留時(shí)間和2個(gè)離子對(duì)符合的情況。由此可知,本方法篩選出的核桃、杏仁、大豆和花生特征肽段間不存在相互干擾，確保了方法的專屬性。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

大豆、花生為核桃露和杏仁露中最常見的摻假成分，采用本方法對(duì)核桃露和杏仁露中摻入大豆和花生進(jìn)行了定量檢測(cè)，即考察了核桃露中大豆和花生、杏仁露中大豆和花生的檢出限、回收率等性能參數(shù)。分別選擇響應(yīng)較高的3個(gè)肽段進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4.1 線性關(guān)系和檢測(cè)限考察

取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，各特征肽段濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明各肽段組分在0.002 5～5 mg/mL線性關(guān)系良好。用核桃露和杏仁露酶解后的多肽混合溶液逐級(jí)稀釋大豆和花生酶解后的多肽混合溶液，同時(shí)用水逐級(jí)稀釋核桃露和杏仁露的酶解多肽溶液，按照方法進(jìn)樣檢測(cè)，以信噪比為3計(jì)算各特征肽段的檢出限，并根據(jù)各物種的蛋白質(zhì)濃度計(jì)算各特征肽段對(duì)應(yīng)的大豆、花生在核桃和杏仁露中的檢出限，和核桃、杏仁成分在水溶液中的檢出限，結(jié)果如表3所示。

表2 核桃、杏仁、大豆、花生的特征肽段及MRM參數(shù)Table 2 Marker peptides and MRM parameters in walnut,almond,soybean and peanut

a-核桃; b-杏仁; c-大豆; d-花生圖3 核桃、杏仁、大豆、花生特征肽段的提取離子流色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of the marker peptides for walnut,almond,soybean and peanut

2.4.2 方法的準(zhǔn)確度和精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確性，即方法測(cè)定值與真實(shí)值之間的差異。按照1.2中的制漿方法制作含有大豆、花生的核桃露和杏仁露，按照前處理方法進(jìn)行提取，上機(jī)測(cè)定飲料樣品中的大豆、花生成分含量，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確度和精密度由。表4可知，除了花生的特征肽段AH Q DSNGDR在核桃露中的回收率為123.5%外，其他花生特征肽段的回收率均在71%～106%之間，且3次測(cè)定的RSD值均<16%(n=3)，大豆特征肽段的回收率均在69%～115%之間，3次測(cè)定的RSD值均<15%(n=3)，說明該方法有良好的抗干擾能力，能夠?qū)崿F(xiàn)核桃露和杏仁露中大豆、花生成分的檢測(cè)。

a-大豆中核桃、杏仁和花生特征肽段的MRM提取離子流圖；b-花生中核桃、杏仁和大豆特征肽段的MRM提取離子流圖；c-杏仁中核桃、大豆和花生特征肽段的MRM提取離子流圖；d-核桃中杏仁、大豆和花生特征肽段的MRM提取離子流圖圖4 肽段特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 erification results of peptide specificity

表3 核桃、杏仁、大豆、花生特征肽段的線性關(guān)系、線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)和檢出限Table 3 Linear range, linear equations, correlation coefficients(r2) and LODs of the marker peptides of walnut, almond, soybean and peanut

2.4.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

以所建立的方法對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買的4個(gè)品牌6個(gè)核桃露、杏仁露和核桃杏仁露樣品進(jìn)行檢測(cè)，6個(gè)樣品中均檢出大豆和花生成分，其中1個(gè)核桃杏仁露復(fù)合蛋白飲料樣品中只檢測(cè)到了杏仁成分，未檢出核桃成分，可能是核桃投料過少，低于目前檢出限。

表4 大豆和花生6 個(gè)特征肽段的回收率和精密度Table 4 Reco eries and RSDs of the six marker peptides of soybean and peanut

3 結(jié)論

本研究采用HPLC-Q-Exacti e-MS和HPLC-QQQ-MS相結(jié)合，篩選出了核桃、杏仁、大豆和花生的特征肽段，并建立了以特征肽段為檢測(cè)對(duì)象的核桃露和杏仁露中植物源性成分的測(cè)定方法，該方法有較高的靈敏度和專屬性，可以同時(shí)測(cè)定多種植物源性成分，由于氨基酸序列在加工過程中比核酸序列更容易保存，因此利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜鑒別多肽在植物蛋白飲料摻假檢測(cè)中具有較大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和重要的現(xiàn)實(shí)意義。