王忠合，李曉婷，胡文梅，王軍

(韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州，521041)

單叢烏龍茶是從國家級(jí)優(yōu)良品種鳳凰水仙選育出的優(yōu)異單株(株系)，屬于極其寶貴的品種資源，種植歷史悠久，主產(chǎn)于廣東省潮州市鳳凰山，是全國名茶之一，其成品茶品質(zhì)優(yōu)異，香味獨(dú)具一格[1-2]。成茶中的氨基酸與茶葉種類、加工程度等有密切關(guān)系，是影響茶營養(yǎng)保健功能及風(fēng)味品質(zhì)的關(guān)鍵化學(xué)成分之一，茶葉中含有多達(dá)26種氨基酸，含量約為2%～5%，其中茶氨酸占氨基酸總量的50%左右，約占茶葉干重的1%～3%。茶氨酸作為茶葉特有的化學(xué)成分，不僅構(gòu)成茶湯鮮爽味，還能降低茶的苦澀味，在提神、鎮(zhèn)靜、降血壓、抗癌和減肥等方面都具有較好的功效作用[3-5]。游離氨基酸的含量和組成對(duì)茶湯的滋味、色澤有較明顯的影響，對(duì)茶湯的香氣和鮮爽度起著決定性作用[6]。由于茶原料、加工、制作方法的不同，茶氨酸及其他游離氨基酸在各類茶葉中的含量存在非常大的差異，輕度發(fā)酵的白茶和未發(fā)酵的綠茶中游離氨基酸的含量較高，白茶比深度發(fā)酵的黑茶中的含量高約90倍[7-8]，這與不同種類的茶特有的口感和風(fēng)味密切相關(guān)。因而準(zhǔn)確測(cè)定茶葉中各游離氨基酸的含量，對(duì)于評(píng)定其營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味特性具有重要意義。

高效液相色譜法用于測(cè)定食品中氨基酸的含量已進(jìn)行了大量的研究，由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收及熒光發(fā)射特性，需要用質(zhì)譜直接檢測(cè)，也可采用衍生化后用紫外吸收或熒光檢測(cè)器檢測(cè)，常用的衍生劑有：6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺碳酸鹽(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC)[7]、鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)[9]、異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)[10]、2,4-二硝基氟苯[11]、丹磺酰氯(dansyl chloride，dabsyl-Cl)[5]和9-芴甲氧羰酰氯(9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl)[12]等，其中OPA衍生化方法簡單、反應(yīng)迅速、易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但衍生物穩(wěn)定性低，且不能與仲氨酸反應(yīng)；FMOC-Cl和PITC可與一級(jí)和二級(jí)氨基酸反應(yīng)，但其副產(chǎn)物較多進(jìn)而干擾測(cè)定，且PITC衍生體系中的三乙胺試劑在質(zhì)譜中的響應(yīng)特別靈敏，會(huì)抑制其他物質(zhì)的離子化，殘留性高、很難清洗干凈，在質(zhì)譜的后續(xù)使用會(huì)出現(xiàn)三乙胺峰的干擾；dabsyl-Cl具有衍生迅速、樣品制備簡單、靈敏度高；AQC屬于專用衍生劑，具有衍生反應(yīng)步驟簡單、所需時(shí)間短、副反應(yīng)少、產(chǎn)物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且采用串聯(lián)質(zhì)譜法替代紫外吸收或熒光檢測(cè)器分析衍生產(chǎn)物，不僅能夠利用質(zhì)核比的差異區(qū)分共洗脫物，而且還能增加其檢測(cè)靈敏度[7]。而隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，可以有效排除復(fù)雜食品基質(zhì)中雜質(zhì)引起的背景干擾，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精確度，并且與二級(jí)質(zhì)譜圖庫比對(duì)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物的驗(yàn)證，從而實(shí)現(xiàn)快速篩查和定量測(cè)定食品中氨基酸的含量[13-14]，加之高分辨質(zhì)譜技術(shù)在快速篩查過程中不需要標(biāo)準(zhǔn)品，因此，高分辨質(zhì)譜技術(shù)在食品分析檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用必將進(jìn)入一個(gè)飛速發(fā)展的階段。本實(shí)驗(yàn)選取5種鳳凰單叢烏龍茶為研究對(duì)象，利用超高壓液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(ultra-high pressure liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOF MS)測(cè)定游離氨基酸的含量，為單叢烏龍茶中游離氨基酸的準(zhǔn)確鑒別和定量測(cè)定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單叢烏龍成茶，于2018年4月采購于廣東省潮州市鳳凰山茶園;谷氨酸(Glu)、異亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、脯氨酸(Pro)、組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸( al)、反式-4-羥基-脯氨酸(Hpro)等,Sigma-Aldrich公司；茶氨酸(The)、茚三酮，生工生物工程(上海)有限公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈和甲醇,Fisher公司；KCl、KH2PO4、K2HPO4、濃鹽酸、三乙胺、無水乙酸鈉、正己烷、冰乙酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇等均為分析純；超純水(電阻率≥18.0 MΩ·cm)，實(shí)驗(yàn)室自制。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取22種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，用體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液溶解，配成100 mg/L的儲(chǔ)備液。吸取一定量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用等體積比的乙腈-水(含0.1%甲酸)溶液稀釋配成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，過0.22 μm濾膜，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity超高壓液相色譜儀，由二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、脫氣機(jī)、紫外檢測(cè)器組成，安捷倫有限公司；Xe o G2-XS QTOF高分辨質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)，沃特世有限公司；JY3002電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ZX4漩渦振蕩器，意大利 ELP公司；JSP-200型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；WFJ 7200可見光分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；GWA-UN1-10超純水器，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶葉樣品處理及氨基酸的提取

分別將茶葉樣品置于干燥粉碎機(jī)中，粉碎過40目篩，-20 ℃冷藏，備用。稱取3.0 g磨碎樣品于500 mL藍(lán)蓋瓶中，加入沸蒸餾水100 mL，立即移入沸水浴中浸提20 min，浸提后立即趁熱減壓過濾，將濾液冷卻后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，待用。

1.3.2 比色法測(cè)定氨基酸的總量

采用GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》[15]測(cè)定提取液中氨基酸的總量，準(zhǔn)確吸取1.0 mL樣品提取液或標(biāo)準(zhǔn)工作液，注入25 mL比色管中，加入0.5 mL pH 8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 20 mg/mL茚三酮溶液，在沸水浴中加熱15 min。待冷卻后加水定容至25 mL。放置10 min后，在570 nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度。分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=0.0612X-0.0234(R2=0.9967)求得氨基酸的質(zhì)量濃度，代入公式(1)計(jì)算出樣品中總氨基酸的含量：

式中:ω,氨基酸的含量，mg/kg；ρ,由標(biāo)曲求得的質(zhì)量濃度，mg/L；,樣液定容體積，mL；m,取樣質(zhì)量，g。

1.3.3 超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定各氨基酸含量

取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液或樣品上清液分別過0.22 μm濾膜后采用UHPLC-QTOF MS進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出茶葉中各游離氨基酸的含量。色譜條件[16-17]：HILIC-Z色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；流速 0.4 mL/min；柱溫 30.0 ℃；進(jìn)樣量 2 μL；洗針進(jìn)樣，流動(dòng)相A：20 mmol/L甲酸銨水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)、流動(dòng)相B：乙腈(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)，梯度洗脫(優(yōu)化后的程序如表1)。質(zhì)譜條件：正離子靈敏度模式檢測(cè)，掃描范圍m/z50～600，毛細(xì)管電壓2.63 k ，錐孔電壓40 ，提取錐孔電壓6 ，離子源溫度130 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣流速60 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，掃描時(shí)間0.2 s。全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)(MS)采集方法：第1通道碰撞能量6 e 、第2通道碰撞能量15、25和35 e 。全信息質(zhì)譜數(shù)據(jù)(MSE)采集方法：低能通道碰撞能量6 e 、高能通道碰撞能量從10增至35 e 。2種采集模式下的數(shù)據(jù)類型均為棒狀圖、采用質(zhì)量鎖定技術(shù)校正以獲取準(zhǔn)確有效的質(zhì)量數(shù)測(cè)量值，以200 pg/μL的亮氨酸腦啡肽溶液為鎖定質(zhì)量溶液，流速為10 μL/min，電壓為2.0 k ，每隔30 s采集1次，在正離子模式下產(chǎn)生m/z556.277 1的離子。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program employed for the separation of amino acids

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取2.0 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液置于10 mL容量瓶中，加體積比為1∶1的乙腈-水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%單酸)稀釋至刻度，搖勻，制成標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算氨基酸的峰面積和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

稱取單叢烏龍茶葉樣品9份，分別提取后置10 mL容量瓶中，精密加入2.0 mL氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平(1、10、50倍定量限)，加適量體積比為1∶1的乙腈-水溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%單酸)，超聲處理15 min，取出，冷卻至室溫，再稀釋至刻度，搖勻，分別作為低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度回收率組，每個(gè)質(zhì)量濃度水平配制3 份，配制的溶液過0.22 μm微孔濾膜，注入超高壓液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Waters公司的MassLynx 4.1軟件，通過提取離子峰獲得化合物的色譜圖并選用ApexTrack的積分方法，適當(dāng)調(diào)整積分參數(shù)的方式完成色譜積分，根據(jù)質(zhì)譜圖中碎片離子峰的識(shí)別與峰匹配情況確認(rèn)化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，并采用鄧肯檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，以P<0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量是影響質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果的重要因素，錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度[11]，過高的錐孔電壓會(huì)導(dǎo)致分子離子在離子源內(nèi)發(fā)生碰撞解離，影響母離子的豐度，進(jìn)而影響檢測(cè)限和靈敏度。本文采用的MSE和MS兩種質(zhì)譜采集模式均可采集母離子和碎片離子，但不同采集模式對(duì)準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰的豐度及數(shù)量的影響較大，將氨基酸標(biāo)樣混合溶液注入質(zhì)譜儀，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，以獲得最優(yōu)的靈敏度和較多的碎片離子，且豐度值較高，如茶氨酸在不同質(zhì)譜采集模式下的結(jié)果如圖1所示。

a-MS采集模式;b-MSE采集模式;c-茶氨酸碎片離子和母離子圖1 不同采集模式MS和MSE下的茶氨酸碎片離子和母離子質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrograms of theanine fragment and parent ions in MS and MSE acquisition modes

MSE采集模式是利用低能通道和高能通道2種掃描快速切換交替構(gòu)成，分別記錄母離子及碎片離子信息，可以進(jìn)行鑒別和定量分析，但此模式的高能通道中碰撞能量只能設(shè)定范圍值。MS采集模式也是采用低能通道掃描獲得母離子信息，而高能通道的碰撞能量則有多種設(shè)置方式，如：固定值、一組值或范圍值等。由圖1可知，茶氨酸的一級(jí)質(zhì)譜圖中主要有加合H+、加合Na+的準(zhǔn)分子離子峰和脫去氨的離子峰，且脫氨的離子峰的豐度最高，用于定量分析可提高檢測(cè)限和靈敏度[17]，其他氨基酸的定量離子峰如表2。而在MS(碰撞能15 )和MSE(碰撞能10～35 )2種不同采集模式下獲得的茶氨酸高能通道質(zhì)譜圖中各碎片離子的數(shù)量和豐度差異較大，MS采集模式中共獲得7個(gè)準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰，準(zhǔn)分子離子峰的豐度較低，大多數(shù)的準(zhǔn)分子離子在碰撞中變成碎片離子，故在m/z84.044 7處的豐度較高；而MSE采集模式中可獲得9個(gè)準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰，準(zhǔn)分子離子峰的豐度較清晰，碎片離子峰的豐度較低，但在m/z158.082 4處的離子峰豐度最高，該采集模式獲得的碎片離子信息多更適合于鑒別茶葉中的各種氨基酸，因而后續(xù)研究中質(zhì)譜采用MSE模式采集。

表2 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的精確質(zhì)量及相關(guān)數(shù)據(jù)Table 2 Monoisotopic mass and related data of standard amino acids

2.2 色譜參數(shù)的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)初期，分別采用了SB-C18柱(250 mm×4. 6 mm，5.0 μm)、EC-C18柱(100 mm×2. 1 mm，2.7 μm)和HILIC-Z柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，在二元流動(dòng)相為甲酸銨-甲酸水溶液-乙腈的梯度洗脫條件下，對(duì)22種氨基酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分離條件的優(yōu)化。C18柱的分離效果明顯不如HILIC-Z柱，部分氨基酸的出峰時(shí)間重合無法分離，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸的峰重合，這主要是由于3種氨基酸的水溶性較好，在C18柱上的保留差，分離效果較差。亮氨酸和異亮氨酸在C18柱上也比較難實(shí)現(xiàn)分離，由于這2種氨基酸具有相同的質(zhì)核比，因而無法進(jìn)行鑒別和定量分析[13]。鑒于此，優(yōu)化了HILIC-Z柱分離氨基酸的色譜條件，采用同樣的二元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫優(yōu)化，如圖2所示，氨基酸標(biāo)準(zhǔn)化合物的分離效果理想，亮氨酸和異亮氨酸可分開，且分離時(shí)間只需15 min，降低了分析所需時(shí)間和溶劑的消耗等，能夠達(dá)到快速、高效分離的要求，且該分離條件不需添加三乙胺和難揮發(fā)性的無機(jī)鹽，只用到揮發(fā)性的甲酸和甲酸銨改性劑，非常適合于質(zhì)譜檢測(cè)，優(yōu)化后的梯度洗脫條件如表1所示。

2.3 方法學(xué)考察

移取適量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入到單叢烏龍茶樣品粉末中，按照1.3.1小節(jié)的方法處理，配制系列質(zhì)量濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定，各氨基酸的檢測(cè)結(jié)果如表3所示。依據(jù)各氨基酸的定量離子峰(如表2)提取的色譜圖中信噪比(S/N)大于3和10得到檢測(cè)限與定量限，22種目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)為0.99～0.9996，樣品中各測(cè)定出的氨基酸化合物均在線性范圍內(nèi)，檢測(cè)限為1.3～95.7 μg/L。

表3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、檢測(cè)限及定量限Table 3 Retention time, standard cur e equation, limits of detection (LOD) and limits of quantitation (LOQ) of standard amino acids

續(xù)表3

移取適量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入到單叢烏龍茶樣品粉末中，配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平(1、10、50倍定量限)的添加試驗(yàn)，各平行5份，按照1.3.1小節(jié)的方法處理，回收率和精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表4所示。由表4可知，各氨基酸目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為83%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，可用于單叢茶樣品中氨基酸含量的測(cè)定。

表4 單叢烏龍茶樣品中氨基酸測(cè)定的添加回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 單位：%

2.4 茶葉樣品中氨基酸鑒別與含量測(cè)定

圖3為單叢茶樣品測(cè)定的總離子流圖和不同質(zhì)量窗口提取的茶氨酸和精氨酸的準(zhǔn)分子離子色譜圖。提高質(zhì)量數(shù)測(cè)定的準(zhǔn)確度，有利于提高篩查鑒別的可靠性，減少假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。串聯(lián)質(zhì)譜可區(qū)分質(zhì)核比的精度只有0.01 Da，借助碎片離子可定量測(cè)定和區(qū)分化合物，但對(duì)于共流出的質(zhì)核比相近的碎片則無能為力。而高分辨質(zhì)譜則可精確到0.1 mDa，再根據(jù)碎片離子質(zhì)譜信息和同位素豐度比值等信息可對(duì)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確篩查和確證。如圖3-b所示，在提取質(zhì)量窗口為0.05 Da下提取茶氨酸(m/z175.108)和精氨酸(m/z175.120)的色譜圖中均在6.83 min會(huì)出現(xiàn)同1個(gè)色譜峰，而當(dāng)提取質(zhì)量窗口為0.005 Da下提取精氨酸(m/z175.120)的色譜圖中不會(huì)出現(xiàn)干擾峰，可準(zhǔn)確提取到精氨酸的色譜峰。茶氨酸和精氨酸的平均相對(duì)分子質(zhì)量為174.197 7和174.201，2種化合物失去1個(gè)氨基(m/z17)和1個(gè)羧基(m/z45)得到的碎片離子峰也相同[18]，因而串聯(lián)質(zhì)譜的質(zhì)量精度無法區(qū)分這兩種氨基酸，已報(bào)道的茶氨酸測(cè)定方法中未考慮精氨酸的影響，m/z158的峰推測(cè)錯(cuò)誤[19]。由表2可知，茶氨酸和精氨酸的單同位素精確質(zhì)量數(shù)為174.111 67和174.100 43，兩者相差約11 mDa，只有用高分辨質(zhì)譜才能準(zhǔn)確區(qū)分。由此可見，采用高質(zhì)量的色譜圖可減少假陽性的篩查結(jié)果，獲得清晰信噪比高的色譜圖，有利于提高檢出限。

a-總離子流圖;b-色譜圖圖3 單叢烏龍茶樣品測(cè)定的總離子流圖及不同質(zhì)量窗口下的茶氨酸及精氨酸提取色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram of Oolong tea extract and extracted ion chromatogram of arginine and theanine in different mass chromatogram window

高分辨質(zhì)譜法可以提供化合物的保留時(shí)間，質(zhì)譜碎片離子、精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比值等信息，這些信息可為化合物的準(zhǔn)確定性和篩查鑒別提供充分的依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)化合物的碎片離子信息確定其在茶葉樣品中的存在情況，并根據(jù)提取色譜圖的峰面積進(jìn)行定量，結(jié)果如表5所示。

表5 單叢烏龍成茶中氨基酸種類與含量 單位：mg/100 g

由表5可知，采用UHPLC-QTOF法測(cè)定的5種單叢烏龍成茶中游離氨基酸的種類相同，主要有茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸等，但各氨基酸在不同單叢烏龍成茶中的含量差異較大(P<0.05)，不同茶葉中各游離氨基酸的加和值相差較大，這可能與茶樹品種、生長環(huán)境、加工條件等因素密切相關(guān)，如玉蘭香茶葉中茶氨酸和天冬氨酸的含量較高，而谷氨酸的含量較低。采用茚三酮比色法測(cè)定的5種單叢烏龍成茶中氨基酸總量差異顯著(P<0.05)，且與各游離氨基酸的加和值差異較大，這可能是由于茶葉提取液中含有其他氨基化合物，因而茚三酮比色法測(cè)定的氨基酸總量值偏大，這進(jìn)一步表明不同成茶中游離氨基酸種類和含量有較大差異，與其種類和加工過程密切相關(guān)。晾青過程中在酶的作用下蛋白質(zhì)水解的游離氨基酸含量增加，這與加工過程中內(nèi)源性蛋白酶被激活，蛋白質(zhì)在各種蛋白酶的催化作用下水解成多種游離氨基酸，使游離氨基酸的總量增加[7]，從分子和蛋白水平看，茶葉晾青過程中茶氨酸的生物代謝與CsFd-GOGAT和CsNADH-GOGAT基因的表達(dá)密切相關(guān)[20]。發(fā)酵過程中游離氨基酸可發(fā)生氧化脫氨或脫羧反應(yīng)形成芳香物質(zhì)，也可通過羰氨反應(yīng)產(chǎn)生香氣成分，從而使得游離氨基酸的含量降低，其中茶氨酸作為一種茶樹特征性非蛋白主體氨基酸可與兒茶素結(jié)合形成黃酮堿類物質(zhì)，這與烏龍茶獨(dú)特香味形成有密切聯(lián)系，因而在不同的成茶中其含量差異較大。

3 結(jié)論

HILIC柱分離單叢烏龍成茶中氨基酸的效果理想，亮氨酸和異亮氨酸在15 min內(nèi)即可分開，該分離條件不需添加三乙胺和難揮發(fā)的鹽，非常適合用于質(zhì)譜檢測(cè)。質(zhì)譜采集模式對(duì)準(zhǔn)分子離子峰和碎片離子峰的豐度及數(shù)量的影響較大，在電噴霧正離子化(ESI+)檢測(cè)，22種氨基酸目標(biāo)物的線性相關(guān)系數(shù)為0.99～0.9996，檢出限為1.3～66.8 μg/L，加標(biāo)回收率為83%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，可用于單叢烏龍茶樣品中氨基酸含量的測(cè)定。

茚三酮比色法測(cè)定5種單叢茶樣品中總游離氨基酸的總量為485.12～575.95 mg/100 g，差異顯著(P<0.05)。超高壓液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定結(jié)果表明，5種單叢烏龍成茶樣品中游離氨基酸的種類相同，主要有茶氨酸、谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、天冬氨酸等，但各氨基酸在不同單叢烏龍成茶中的含量差異較大(P<0.05)，這與不同品種的單叢烏龍茶獨(dú)特的香味形成及口感有密切聯(lián)系。