楊露露 李林
摘? ?要? ?通過(guò)比較藍(lán)色葉翠云草、紅色葉翠云草和綠色葉小翠云三者葉綠素合成途徑中11種產(chǎn)物的含量變化,分析翠云草葉綠素代謝途徑及其關(guān)鍵酶,為深入研究翠云草葉色變化內(nèi)在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示,“原卟IX→鎂原卟啉IX”“原葉綠酸酯→葉綠酸酯a”這兩個(gè)環(huán)節(jié)是翠云草葉綠素代謝途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié),鎂離子螯合酶(CHLH)、光依賴(lài)的原葉綠酸酯氧化還原酶(LPOR)是相應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵酶。基于對(duì)翠云草葉綠素代謝途徑的分析,推測(cè)翠云草中葉綠素a轉(zhuǎn)化為葉綠素b的效率大于其反向轉(zhuǎn)化的效率,導(dǎo)致葉綠素a/b值小于2,以適應(yīng)翠云草生長(zhǎng)的蔭蔽環(huán)境,滿(mǎn)足其葉綠素需求。
關(guān)鍵詞? ?翠云草;葉綠素;代謝途徑;關(guān)鍵酶
中圖分類(lèi)號(hào):S68? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A? ? DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.25.001
彩葉植物尤其是藍(lán)色葉植物在園林景觀(guān)應(yīng)用中較為少見(jiàn)。卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)的翠云草(Selaginella uncinata)是一種藍(lán)色葉的蕨類(lèi)植物,極具觀(guān)賞價(jià)值[1]。其葉片如羽毛般柔軟,在蔭蔽條件下呈現(xiàn)藍(lán)色,在全光照下變?yōu)榘导t色,葉色變化呈現(xiàn)的景觀(guān)效果很獨(dú)特,具有廣闊的園林應(yīng)用前景。
迄今為止,國(guó)內(nèi)外對(duì)翠云草的研究主要集中在基因組學(xué)、栽培繁殖、化工及藥理學(xué)方面。Tsuji等[2]、Smith[3]、Oldenkott等[4]對(duì)翠云草進(jìn)行了基因組學(xué)方面的研究。H Bant等研究了卷柏屬的藤卷柏(S. willdenovii)和翠云草,利用透射電子顯微鏡觀(guān)察其葉片橫切面的組織構(gòu)造,認(rèn)為翠云草的藍(lán)色葉與其葉片上層表皮的外側(cè)細(xì)胞壁內(nèi)兩層薄膜干涉濾器引發(fā)光的薄膜干涉有關(guān)[5]。鄭俊霞等[6]、邱宏聰?shù)萚7]、賴(lài)紅芳等[8]對(duì)翠云草的化學(xué)組成、提取工藝、藥理作用等進(jìn)行了研究。黃莉潔[9]、張旭樂(lè)等[10]、楊俊杰[11]總結(jié)了翠云草的引種人工栽培和繁殖技術(shù)。李林等[12]、LI L等[13]、張水木等[14]從翠云草葉色變化及其分子機(jī)理等方面探討了翠云草呈色變化機(jī)制。
本研究通過(guò)比較三種植物材料(藍(lán)色葉翠云草、紅色葉翠云草和綠色葉小翠云)葉綠素合成途徑中11種中間產(chǎn)物含量的變化,探討翠云草葉綠素代謝途徑的特點(diǎn)及關(guān)鍵酶,為深入研究翠云草葉色變化的內(nèi)在機(jī)制,最終實(shí)現(xiàn)人工調(diào)控葉色奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)基地位于廣西大學(xué)林學(xué)院苗圃(22°50′N(xiāo),108°17′E)。盆栽(株齡均為6個(gè)月)翠云草和同屬的小翠云(S. kraussiana)購(gòu)自廣西花鳥(niǎo)市場(chǎng),參照李林等[12]的方法對(duì)所用植物材料進(jìn)行預(yù)處理,得到全光照下栽培的紅色葉翠云草(圖1B),用于和放在三層遮蔭條件下栽培的藍(lán)色葉翠云草(圖1A)和綠色葉小翠云(圖1C)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。
1.2 試驗(yàn)方法
隨機(jī)采集植株各個(gè)方向正常生長(zhǎng)的成熟葉片,測(cè)定葉綠素生物合成各產(chǎn)物的含量。
1.2.1 葉綠素合成前體物質(zhì)的測(cè)定
利用全自動(dòng)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定葉綠素合成前體物質(zhì)的吸光值,其中δ-氨基酮戊酸(ALA)、膽色素原(PBG)、尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)、糞卟啉Ⅲ(Coprogen Ⅲ)、原卟啉IX(Proto IX)、鎂原卟啉IX(Mg-Proto IX)和原葉綠酸酯(Pchlide)含量的測(cè)定參照宗學(xué)鳳[15]、趙明輝等[16]、王平榮等[17]、楊海蕓[18]的方法,并適當(dāng)調(diào)整,單位均采用nmol·g-1。
1.2.2 葉綠素及其衍生物含量的測(cè)定
利用高效液相色譜法(WATERS E2695 HPLC系統(tǒng))對(duì)葉綠素及其衍生物含量進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),利用保留時(shí)間和峰面積確定樣品中的物質(zhì)種類(lèi)和含量。標(biāo)準(zhǔn)品葉綠素a(Chl a)和葉綠素b(Chl b)購(gòu)于Sigama公司。標(biāo)準(zhǔn)品葉綠酸酯a(Chlide a)和葉綠酸酯b(Chlide b)利用翠云草葉片中葉綠素酶(Chlase,參照Costa[19]的方法提?。┓謩e以標(biāo)準(zhǔn)品Chl a和Chl b為底物發(fā)生反應(yīng)得到,所得的Chlide a和Chlide b僅可進(jìn)行定性,無(wú)法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣中Chlide a和Chlide b的具體含量,因此在結(jié)果分析中以樣品中檢測(cè)出的峰面積相對(duì)比較三種植物材料葉片中Chlide a和Chlide b含量情況。
葉綠素及其衍生物的HPLC分析參照程紅艷等[20]的方法,略加改進(jìn)。取0.15 g植物葉片迅速加入5 mL甲醇溶液充分浸泡,并用超聲波機(jī)器震蕩15 min至無(wú)色,過(guò)濾待測(cè)。檢測(cè)條件為柱型C18(4.6 mm×250 mm,德國(guó)Nucleodur色譜柱),檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm,流動(dòng)相為A(甲醇、水的體積比為80∶20)和B(乙酸乙酯)。梯度洗脫為:0~20 min,A 100%~50%,B 0%~50%;20~40 min,A=50%,B=50%。流速設(shè)置為0.8 mL·min-1,進(jìn)樣量為10 μL。
1.3 數(shù)據(jù)整理
利用Word 2010、Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、制圖、制表,利用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 葉綠素合成前體物質(zhì)含量分析
從表1可以看出,除Coprogen Ⅲ外,其余各產(chǎn)物含量在三種葉色中都具有顯著性差異,但其大小的變化趨勢(shì)在三種葉色中不一致。
2.2 葉綠素及其衍生物分析
2.2.1 葉綠素及其衍生物HPLC圖譜
圖2為三種植物材料在430 nm處的葉綠素及其衍生物HPLC色譜圖。各主要物質(zhì)的出峰時(shí)間分別為:Chl a,29.846 min;Chl b,26.169 min;Chlide a,11.788 min。除Chlide b以外,另外3種物質(zhì)在三種植物材料中均可以檢測(cè)到。此外,三種葉色都在17.669 min處檢測(cè)到脫鎂葉綠素a(Pheide a)。
2.2.2 葉綠素及其衍生物含量分析
表2顯示,除葉綠素a/b外,三種植物材料中Chl a、Chl b、Chl a+b和Chlide a都存在顯著差異。Chl a、Chl b、Chl a+b的大小變化趨勢(shì)相同,都是藍(lán)色葉>綠色葉>紅色葉,且3種葉色中都是Chl a>Chl b。Chlide a的大小變化則是綠色葉>藍(lán)色葉>紅色葉。葉綠素a/b值均小于2,大小依次為紅色葉>綠色葉>藍(lán)色葉。
2.3 葉綠素合成產(chǎn)物相對(duì)含量比較
為了便于更直觀(guān)地分析和描述,將藍(lán)色葉中各物質(zhì)含量設(shè)定為100,與紅色葉和綠色葉進(jìn)行比較,且分別將葉綠素合成過(guò)程ALA→PBG→Urogen III→Coprogen Ⅲ→Proto IX→Mg-Proto IX→Pchlide→Chlide a→Chl a→Chl b命名為階段①~階段⑨,結(jié)果見(jiàn)圖3(參考楊露露[21]并做了一些改動(dòng))。
1)在階段①,紅色葉中合成的前體物質(zhì)由原來(lái)藍(lán)色葉的135.25%下降到89.09%,緊接著在階段②又上升到148.99%,在階段③和階段④中,紅色葉>藍(lán)色葉的趨勢(shì)不變,但到了階段⑤,紅色葉中的合成產(chǎn)物急劇下降為藍(lán)色葉的32.39%,其后一直保持低于藍(lán)色葉的趨勢(shì)。根據(jù)以上藍(lán)色葉和紅色葉的比較分析,推測(cè)階段①ALA→PBG、階段②PBG→Urogen III和階段⑤Proto IX→Mg-Proto IX是翠云草葉綠素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
2)在階段③,綠色葉中合成的前體物質(zhì)由原來(lái)藍(lán)色葉的37.46%上升到100.76%,緊接著在階段④又下降到藍(lán)色葉的70.32%,在階段⑤和階段⑥中,藍(lán)色葉>綠色葉的趨勢(shì)不變,但到了階段⑦,綠色葉中的合成產(chǎn)物快速上升為藍(lán)色葉的128.34%,隨后階段⑧又急劇下降為71.06%,其后保持低于藍(lán)色葉的趨勢(shì)。根據(jù)以上藍(lán)色葉和綠色葉的比較分析,推測(cè)階段③Urogen III→Coprogen Ⅲ、階段④Coprogen Ⅲ→Proto IX、階段⑦Pchlide→Chlide a和階段⑧Chlide a→Chl a是翠云草葉綠素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
2.4 翠云草葉綠素合成產(chǎn)物相關(guān)性分析
將翠云草葉綠素合成途徑各中間產(chǎn)物:ALA、PBG、Urogen III、Coprogen III、Proto IX、Mg-Proto IX、Pchlide、chlide a的含量分別與葉綠素指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果(見(jiàn)表3)顯示,前4個(gè)中間產(chǎn)物ALA、PBG、Urogen III、Coprogen III的含量與葉綠素各指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系,而后4個(gè)中間產(chǎn)物Proto IX、Mg-Proto IX、Pchlide、Chlide a的含量與葉綠素各指標(biāo)(除Chl a/b外)顯著相關(guān)。
3 討論與結(jié)論
3.1 翠云草的耐陰性
植物在不同光照強(qiáng)度的生長(zhǎng)環(huán)境中,為滿(mǎn)足體內(nèi)葉綠素性能的需求,可以利用葉綠素循環(huán),自我調(diào)整Chl a和Chl b的比值[22]。一般說(shuō)來(lái),葉綠素含量高、Chl a/b比值小的植物具有較強(qiáng)的耐陰性。低的Chl a/b值能提高植物對(duì)遠(yuǎn)紅光的吸收,因而在弱光下,具有較低的Chl a/b值及較高的葉綠素含量的植物,也具有較高的光合活性。蕨類(lèi)作為典型的陰生植物,Chl a/b值通常小于3∶1[23]。據(jù)丁曉浩等報(bào)道,其所測(cè)的10種觀(guān)賞蕨在3種不同光照處理下的Chl a/b值均小于3∶1,為(0.17~2.49)∶1[23]。
本研究中三種植物材料Chl a/b值均小于2,和丁曉浩等的研究結(jié)果[23]一致。其比值大小依次為紅色葉翠云草>綠色葉小翠云>藍(lán)色葉翠云草,說(shuō)明翠云草比同屬的小翠云耐陰,而紅色葉翠云草是受到強(qiáng)光脅迫形成的[12],其耐陰性最差。
3.2 翠云草葉綠素合成關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵酶
根據(jù)前文(“2.3”節(jié))藍(lán)色葉和紅色葉、綠色葉的比較分析,推測(cè)翠云草葉綠素合成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是階段①ALA→PBG、階段②PBG→Urogen III、階段③Urogen III→Coprogen Ⅲ、階段④Coprogen Ⅲ→Proto IX、階段⑤Proto IX→Mg-Proto IX、階段⑦Pchlide→Chlide a和階段⑧Chlide a→Chl a這7個(gè)環(huán)節(jié)。
通過(guò)“2.4”節(jié)相關(guān)性分析可知,Proto IX、Mg-Proto IX、Pchlide 、Chlide a這4個(gè)產(chǎn)物與葉綠素指標(biāo)顯著相關(guān)。即圖3中的階段④→階段⑦環(huán)節(jié)與葉綠素合成的關(guān)系更為密切。
Li等根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)翠云草葉綠素代謝相關(guān)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)鎂離子螯合酶(CHLH)、光依賴(lài)的原葉綠酸酯氧化還原酶(LPOR)、葉綠素酶(CLH)(即圖3中的階段⑤、階段⑦和階段⑨所對(duì)應(yīng)的3個(gè)酶)在藍(lán)色葉中比紅色葉中均有所上調(diào)[13]。
綜上,我們認(rèn)為階段⑤Proto IX→Mg-Proto IX和階段⑦Pchlide→Chlide a這兩個(gè)環(huán)節(jié)是翠云草葉綠素代謝途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié),CHLH和LPOR是相應(yīng)的兩個(gè)關(guān)鍵酶。
3.3 翠云草葉綠素代謝途徑
楊海蕓對(duì)花葉矢竹(Pseudosasa japonica f. akebonosuji)進(jìn)行葉色突變研究,發(fā)現(xiàn)引起其葉色變異的原因在于:Coprogen III→Proto IX這一中間過(guò)程(圖3中的階段④)生成的Proto IX與上一產(chǎn)物Coprogen III相比較,其相對(duì)含量水平急劇下降,導(dǎo)致花葉矢竹白色條紋葉Chl a、Chl b和總?cè)~綠素的含量均低于綠色葉,致使葉片顏色變淡或白化[18]。孫捷音等發(fā)現(xiàn)油菜(Brassica napus)的葉綠素合成途徑中,從PBG→Urogen III(圖3中的階段②),和野生型相比,其含量降低了一半,是Chl b的缺失造成了葉色突變[24]。董立花采用熒光光譜和紫外可見(jiàn)光譜分析了金心吊蘭(Chlorophytum capense var. Medio-pictum)葉綠素代謝流中間產(chǎn)物的變化,發(fā)現(xiàn)其金心部分ALA、Proto IX和Pchlide的合成(圖3中的起始環(huán)節(jié)和階段④、階段⑥)受阻,且推測(cè)ALA合成受阻可能是其形成黃色葉條紋的主要原因[25]。上述各例都是由于葉綠素合成過(guò)程中Chl a、Chl b和總?cè)~綠素產(chǎn)生變化后導(dǎo)致葉色發(fā)生改變。Li等通過(guò)對(duì)藍(lán)色葉翠云草和紅色葉翠云草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,找到了翠云草葉綠素代謝途徑中幾乎所有的酶,且基于兩個(gè)樣本中的葉綠素合成酶(Chlorophyllsynthase, CS)和葉綠素a加氧酶(CAO)的表達(dá)都沒(méi)有顯著差異的結(jié)果,推斷翠云草中兩種葉綠素的合成都沒(méi)有受阻[13]。
從L-谷氨酰-tRNA到Chl a,再到Chl b,整個(gè)葉綠素生物合成過(guò)程一共15步反應(yīng),需要15種酶參與[17]。葉綠素循環(huán)過(guò)程從Chlide a開(kāi)始,經(jīng)過(guò)CS酯化反應(yīng)形成Chl a。Chl b是由Chl a轉(zhuǎn)化形成的,在此過(guò)程中,Chlide a在CAO的催化下形成Chlide b,Chlide b在CS作用下形成Chl b。而Chl b在一定的條件下也可還原為Chl a。植物可以利用Chl a和b能夠相互轉(zhuǎn)化的反應(yīng)來(lái)調(diào)整葉綠素a/b的比值以適應(yīng)不同的生理?xiàng)l件和環(huán)境變化[26]。通常Chl a和Chl b吸收不同的波長(zhǎng),前者吸收紅光而后者主要吸收藍(lán)紫光,在蔭蔽條件下,Chl b能夠利用環(huán)境中的藍(lán)紫漫反射光適應(yīng)光照條件。本試驗(yàn)應(yīng)用HPLC在三種葉色材料中檢測(cè)到Chl a、Chl b和Chlide a,但均未檢測(cè)到Chlide b,推測(cè)Chlide a在CAO催化下,產(chǎn)生的Chlide b迅速進(jìn)入下一步反應(yīng)生成Chl b,使得Chlide b在代謝流中不積累,即翠云草中Chl a轉(zhuǎn)化為Chl b的效率大于其反向轉(zhuǎn)化的效率,導(dǎo)致葉綠素a/b值小于2,以適應(yīng)翠云草生長(zhǎng)的蔭蔽環(huán)境,滿(mǎn)足其葉綠素需求。
圖4為我們參考Li等[13]并做了一些改動(dòng),總結(jié)出的翠云草葉綠素代謝通路圖。
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(責(zé)任編輯:丁志祥)