曾 媛,宋雅慧,俞 泉,韓晏麒,金晨鐘,2,王 艷,2,張雪嬌,2,胡一鴻,2,*

(1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)藥無(wú)害化應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南婁底 417000; 2.湖南人文科技學(xué)院，湖南省農(nóng)田雜草防控技術(shù)與應(yīng)用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南婁底 417000)

藤黃果(GarciniacambogiaL.)是一種廣泛分布于南亞熱帶地區(qū)的藤黃科喬木,其果實(shí)部分的果皮中富含羥基檸檬酸,果實(shí)具有酸味,在南亞國(guó)家常被用來(lái)作為食物調(diào)料和傳統(tǒng)藥物[1-3]。羥基檸檬酸是ATP檸檬酸裂解酶的強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,具有抑制脂肪酸合成和促進(jìn)糖原異生的作用,能夠增高人體對(duì)丙酮酸和乳酸的利用率,從而起到抑制食欲的目的。羥基檸檬酸能夠調(diào)節(jié)肥胖人群的胰島素和血脂水平,并能提升身體中血清內(nèi)的5-羥基色胺的含量,起到加速身體中能量消耗的作用,而且目前沒有發(fā)現(xiàn)適量攝入羥基檸檬酸具有明顯的毒副作用[4-5]。因此,在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上,羥基檸檬酸常作為減肥功能性食品的有效成分加以應(yīng)用[6-8]。近年的研究也表明,羥基檸檬酸還能抑制腎內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的生成和瓦解泌尿系統(tǒng)的草酸鈣結(jié)晶的功效[9]。

羥基檸檬酸是含有2個(gè)羥基和3個(gè)游離羧基的有機(jī)酸,其特定的分子結(jié)構(gòu)使其在常規(guī)的分離提取過(guò)程中極易自身縮合成內(nèi)酯,導(dǎo)致提取物的生物學(xué)活性喪失,甚至對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生一定的毒副作用[10]。目前工業(yè)制備上從藤黃果中提取羥基檸檬酸主要采用3種方法:水提取法[11]、有機(jī)溶劑提取法[2]和離子交換層析提取法[12]。國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上的藤黃果提取物主要采用上述3種方法用藤黃果的果皮制備。但藤黃果干燥后,其果皮與果肉很難分離,而且現(xiàn)有工藝制備的藤黃果提取物的主要成分為羥基檸檬酸內(nèi)酯,而不是游離的羥基檸檬酸[2,13],目前仍未見高效分離提取游離羥基檸檬酸工藝的報(bào)道。因此,本試驗(yàn)以藤黃果果實(shí)(全果)為原料,采用水提取法,用KOH保護(hù)游離羥基檸檬酸以制備羥基檸檬酸鉀鹽,以料液比、濃縮倍數(shù)、酒精度數(shù)、pH為考察因素,獲取游離羥基檸檬酸鹽的最佳制備方法,并對(duì)提取的羥基檸檬酸進(jìn)行定性與定量檢測(cè),以期為優(yōu)化工業(yè)化生產(chǎn)羥基檸檬酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藤黃果果實(shí)(全果) 貴州黎平博遠(yuǎn)生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司;羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自ChromaDex公司(色譜純);藤黃果提取物 購(gòu)自NowFoods公司;偏礬酸銨 購(gòu)自南京試劑公司;硫酸鈉 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán);其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

40～70%vol酒精度計(jì) 河北武強(qiáng)華鵬儀器廠;N-1100V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社;L535R低速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀;LC-10Avp plus高效液相色譜儀、AUW120D精密分析天平 日本島津;MLS-3750全自動(dòng)蒸汽滅菌鍋 日本三洋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羥基檸檬酸提取 參照Lewis[14]的方法加以改進(jìn)。自然風(fēng)干藤黃果果實(shí)后,取粉碎至40目的藤黃果果實(shí)粉末25 g,加入蒸餾水混勻,于115 ℃高壓蒸煮15 min,冷卻后用5層醫(yī)用紗布過(guò)濾擠壓出濾液,濾液于4000×g離心15 min,55 ℃減壓蒸發(fā)濃縮上清液,然后在濃縮液中按1∶1 (v/v)加入95%乙醇沉淀果膠,雙層紗布過(guò)濾后濾液4000×g離心15 min除去果膠沉淀,上清液中加入95%乙醇用40～70%vol酒精度計(jì)在室溫下調(diào)節(jié)溶液酒精度數(shù)至額定值,然后加入40% KOH調(diào)節(jié)pH,形成油狀沉淀后棄上清液,沉淀用95%乙醇洗滌3次,再用無(wú)水乙醇洗滌沉淀2次后置于常溫下過(guò)夜,然后于60 ℃下減壓蒸發(fā),干燥后稱重。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實(shí)粉末,固定濃縮倍數(shù)為5倍、酒精度數(shù)為60%vol、pH為10,分別在料液比為1∶10、1∶14、1∶18、1∶22的條件下,測(cè)定羥基檸檬酸得率。

1.2.2.2 濃縮倍數(shù)對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實(shí)粉末,固定料液比為1∶10、酒精度數(shù)為60%vol、pH為10,分別在濃縮倍數(shù)為1、3、5、7的條件下,測(cè)定羥基檸檬酸得率。

1.2.2.3 酒精度數(shù)對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實(shí)粉末,固定料液比為1∶10、濃縮倍數(shù)5倍,pH為10,分別在酒精度數(shù)為40、50、60、70%vol的條件下,測(cè)定羥基檸檬酸得率。

1.2.2.4 pH對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 分別取25 g藤黃果果實(shí)粉末,固定料液比為1∶10,濃縮5倍,酒精度數(shù)60%vol,分別在pH為9、10、11、12的條件下,測(cè)定羥基檸檬酸得率。

1.2.3 正交試驗(yàn) 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn),選取液料比、濃縮倍數(shù)、酒精度數(shù)、pH為考察因素,以羥基檸檬酸得率為考察指標(biāo),設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件,因素水平表見表1。

1.2.4 羥基檸檬酸得率 羥基檸檬酸得率按如下公式計(jì)算:

式(1)

1.2.5 藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸的鑒定與定量分析 將提取的樣品、羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品和NowFoods公司的藤黃果提取物進(jìn)行顯色反應(yīng)、薄層層析的初步鑒定,高效液相色譜定量分析,判定本試驗(yàn)提取的樣品。

1.2.5.1 顯色反應(yīng) 顯色反應(yīng)參照Bainto等[15]的方法。稱取0.1 g待測(cè)樣品溶于50 mL 3.0%的磷酸溶液中,40 KHz、0.5 W/cm2超聲波處理30 min后取1 mL上清液,加入3 mL 1%偏礬酸銨,靜置30 min后點(diǎn)樣置于白色搪瓷片上觀察。

1.2.5.2 薄層層析檢測(cè) 取0.1 g待測(cè)樣品溶于0.9 mL 3.0%的磷酸溶液中,40 KHz、0.5 W/cm2超聲波處理30 min后用0. 45 μm水性微孔濾膜過(guò)濾,點(diǎn)樣在活化后的GF254薄層層析硅膠板(2.5×7.5 cm)上,以甲醇∶水=6∶1 (v/v)為展開劑。層析完畢后采用5%偏礬酸銨溶液顯色。Rf值按如下公式計(jì)算:

式(2)

1.2.5.3 高效液相色譜檢測(cè) 參照惠戰(zhàn)鋒等[16]的方法。采用LC-10Avp plus高效液相色譜儀檢測(cè),色譜柱為Wondasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.05 mol/L硫酸鈉,用硫酸調(diào)整pH至2.3,流速為1 mL/min。取50 mg待測(cè)樣品溶于40 mL 3.0%的磷酸溶液中,超聲波處理30 min后用0. 45 μm水性微孔濾膜過(guò)濾,每次上樣量為20 μL,采用紫外檢測(cè)器于210 nm處檢測(cè),采用0.01～0.20 mg/mL的色譜純羥基檸檬酸繪制外標(biāo)曲線進(jìn)行純度測(cè)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

進(jìn)行3次單因素實(shí)驗(yàn)的平行實(shí)驗(yàn),并在正交試驗(yàn)獲取的最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果。采用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性比較(P<0.05)(LSD法),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(M±SE),用小寫字母標(biāo)注顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的增大得率先增大后減小。當(dāng)料液比為1∶14時(shí),羥基檸檬酸得率達(dá)到最大,為2.04%,隨后隨料液比的增大得率緩慢下降。在一定范圍內(nèi),當(dāng)料液比增大,浸提的水分子則能與浸提物充分接觸,提高親水的羥基檸檬酸的得率。但當(dāng)料液比繼續(xù)增大,浸出的效率達(dá)到峰值后,由于浸出物的濃度隨溶劑的體積而稀釋,會(huì)造成浸出物不穩(wěn)定,同時(shí)減壓蒸發(fā)濃縮時(shí)間也會(huì)相應(yīng)增長(zhǎng),過(guò)長(zhǎng)的加熱會(huì)使羥基檸檬酸形成內(nèi)脂[17],也會(huì)造成得率下降。因此,采用料液比1∶14。

圖1 不同料液比對(duì)羥基檸檬酸得率的影響Fig.1 Effects of different solid liquid ratios on recoveryrate of hydroxycitric acid from G. cambogia L.注:用小寫字母標(biāo)注顯著性差異(P<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2 不同濃縮倍數(shù)對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 由圖2可知,隨著濃縮倍數(shù)的增大得率先增大后減小。當(dāng)濃縮倍數(shù)為5倍時(shí),得率為1.58%。當(dāng)濃縮倍數(shù)達(dá)到7倍時(shí),得率顯著下降(P<0.05),僅為0.46%。由于濃縮過(guò)程是在55 ℃的溫度下進(jìn)行,設(shè)定濃縮倍數(shù)過(guò)高時(shí),長(zhǎng)時(shí)間的高溫使得羥基檸檬酸容易形成內(nèi)脂,降低了得率。因此,采用濃縮倍數(shù)為5倍。

圖2 不同濃縮倍數(shù)對(duì)羥基檸檬酸得率的影響Fig.2 Effects of different condensive folds on recoveryrate of hydroxycitric acid from G. cambogia L.

2.1.3 不同酒精度數(shù)對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 由圖3可知,隨著酒精度數(shù)的增加得率先增大后減小。當(dāng)酒精度數(shù)達(dá)到60%vol時(shí),得率達(dá)到最大值,為1.18%。隨著酒精度數(shù)的繼續(xù)增大,得率開始下降。采用乙醇使羥基檸檬酸沉淀是在溶液的一定極性范圍之內(nèi)的,通過(guò)加入乙醇調(diào)整溶液的極性而產(chǎn)生沉淀。當(dāng)溶液的酒精度數(shù)達(dá)到60%vol時(shí),羥基檸檬酸的溶解度達(dá)到最低,充分沉淀出來(lái)。因此,采用酒精度數(shù)為60%vol。

圖3 不同酒精度數(shù)對(duì)羥基檸檬酸得率的影響Fig.3 Effects of different alcohol degrees on recoveryrate of hydroxycitric acid from G. cambogia

2.1.4 不同pH對(duì)羥基檸檬酸得率的影響 由圖4可知,隨著pH的增加得率先增大后減小,當(dāng)pH為11時(shí),得率達(dá)到最大值,為1.56%。羥基檸檬酸為弱酸,在堿性條件下能形成鹽。但堿性條件偏大時(shí),過(guò)高濃度的OH-離子可能會(huì)破壞羥基檸檬酸鹽的穩(wěn)定性,溶液極性的改變會(huì)導(dǎo)致乙醇沉淀效率下降[14,18]。因此,采用pH為11。

圖4 不同pH對(duì)羥基檸檬酸得率的影響Fig.4 Effects of different pH on recovery rate ofhydroxycitric acid from G. cambogia

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取液料比、濃縮倍數(shù)、酒精度數(shù)、pH進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn),以獲取最佳提取條件。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。通過(guò)表2直觀分析顯示,理論最佳提取條件為:A3B2C2D3,即料液比為1∶18、濃縮為5倍、酒精度數(shù)為60%vol、pH為12。影響藤黃果羥基檸檬酸提取效果的因素大小順序依次為A(液料比)>B(濃縮倍數(shù))>D(pH)>C(酒精度數(shù))。在此優(yōu)化提取條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得率為3.24%±0.32%,高于表2試驗(yàn)組合中的最高值,說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果合理。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

以極差值最小的C因素為誤差列[19],正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和F檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)料液比相對(duì)于得率存在顯著性差異(P<0.05),而濃縮倍數(shù)、酒精度數(shù)、pH對(duì)得率的影響并不顯著(P>0.05)(表3)。

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test results

2.3 顯色反應(yīng)與薄層層析

用偏礬酸銨進(jìn)行顯色反應(yīng),發(fā)現(xiàn)羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品、藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸和Now Foods藤黃果提取物均呈紅棕色,而檸檬酸呈淡黃色(圖5)。薄層層析的結(jié)果顯示,羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸、藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸和Now Foods藤黃果提取物的Rf值無(wú)明顯差異,均在0.69～0.71之間,但檸檬酸的Rf值稍低(圖6)。說(shuō)明顯色反應(yīng)和薄層層析能夠定性鑒定羥基檸檬酸和與其結(jié)構(gòu)相似的檸檬酸。

圖5 偏礬酸銨顯色反應(yīng)檢測(cè)羥基檸檬酸Fig.5 Chromogenic reaction with ammoniummonovanadate analysis of hydroxycitric acid注:1:檸檬酸;2:羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品;3:藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸;4:NowFoods藤黃果提取物。

圖6 薄層層析分析檢測(cè)羥基檸檬酸Fig.6 Thin layer chromatographic analysis of hydroxycitric acid注:1:羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品;2:檸檬酸;3:藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸;4:NowFoods藤黃果提取物。

2.4 高效液相色譜檢測(cè)

將提取的樣品進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在保留時(shí)間2.90 min處出現(xiàn)吸收峰,與羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品(2.96 min)和NowFoods公司的藤黃果提取物(2.88 min)保留時(shí)間一致,但NowFoods公司的藤黃果提取物在5.63 min處還有1個(gè)更強(qiáng)的雜質(zhì)峰(圖7),可判定本試驗(yàn)提取的樣品為藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸。經(jīng)3次重復(fù),外標(biāo)法測(cè)得藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸的純度為52.10%±0.53%,NowFoods公司的藤黃果提取物羥基檸檬酸的純度為34.42%±0.48%。

圖7 高效液相色譜檢測(cè)羥基檸檬酸Fig.7 HPLC analysis of hydroxycitric acid注:a:羥基檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品;b:藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸;c:NowFoods藤黃果提取物。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交試驗(yàn)及方差分析,得到了水提取法提取藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸的最佳條件為料液比為1∶18、濃縮為5倍、酒精度數(shù)為60%vol、pH為12。在該試驗(yàn)條件下,羥基檸檬酸的得率為3.24%±0.32%。該方法采用KOH在偏堿性條件下保護(hù)了游離羥基檸檬酸,提取物色譜檢測(cè)為單峰,說(shuō)明不含羥基檸檬酸內(nèi)酯,現(xiàn)有工藝的提取產(chǎn)物主要為羥基檸檬酸內(nèi)酯,在常溫下羥基檸檬酸內(nèi)酯與羥基檸檬酸的比例高達(dá)9∶1[2],而最終產(chǎn)品中的羥基檸檬酸內(nèi)酯殘留可能對(duì)人體產(chǎn)生毒副作用[10,20]。采用偏礬酸銨顯色和薄層層析對(duì)羥基檸檬酸進(jìn)行了初步鑒定,采用高效液相色譜法測(cè)定藤黃果果實(shí)羥基檸檬酸的純度為52.10%±0.53%。本試驗(yàn)工藝參數(shù)對(duì)現(xiàn)有藤黃果羥基酸制備工藝的改進(jìn)具有較強(qiáng)的參考價(jià)值。