張芳雅,包海鷹,圖力古爾

(吉林農(nóng)業(yè)大學,食藥用菌教育部工程研究中心,吉林長春 130118)

水皮子蘑菇為口蘑科(Tricholimataceae)杯傘屬(Clitocybe)真菌落葉杯傘(Clitocybephyllophila(Pers.)P. Kumm.)。水皮子蘑菇是山西省五臺山傳統(tǒng)食用菌。據(jù)《五臺縣志》記載,五臺山蘑菇,號稱“臺蘑”,資源豐富,是山西著名特產(chǎn)之一[1]。臺蘑包含許多重要的食藥用菌[2],李時珍的《本草綱目》中記載臺蘑具有益氣、殺蟲的作用[3]。山西著名方劑舒筋散就是以臺蘑作為主藥,具有舒筋活血、追風散寒等作用[4]。水皮子蘑菇是臺蘑的一種[5],在當?shù)赜直环Q為“水銀盤”,因其獨特的氣味和口感,廣受當?shù)厝嗣窈陀慰偷南矏邸?/p>

該菌在當?shù)厥秤脷v史悠久[6],研究人員已對該菌做了相關分類學的研究,但對其化學成分的研究尚屬空白。目前從大型真菌中提取天然化合物的主要方法是乙醇浸提法和連續(xù)回流提取法,乙醇浸提法提取時間過長所需提取試劑量大,連續(xù)回流提取法較前者所需時間短[7-8]。因此采用連續(xù)回流法進行提取,通過色譜分離技術與波譜分析技術等方法,研究水皮子蘑菇的化學成分。以期了解該食用菌主要化學成分并得到其中的功能性單體化合物,從而更合理的開發(fā)該野生食用菌的價值,為臺蘑的廣泛及深度利用提供參考和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水皮子蘑菇 采自山西五臺山野外;石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等試劑 均為分析純,北京化工廠;柱色譜硅膠 200～300目,青島海洋化工有限公司;Sephadex LH-20(葡聚糖凝膠 LH-20) 北京索萊寶科技有限公司。

Bruker-500M AVIII核磁共振波譜儀 瑞士布魯克公司;Finnigan-MAT LCQ 質(zhì)譜儀 美國Finnigan公司;CP214型電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;X-6顯微熔點測定儀 北京泰克儀器廠;Eyela-N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;Eyela-OSB-2100油浴鍋 上海愛朗儀器有限公司;Eyela-A-1000S水流抽氣機 上海愛朗儀器有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 化學成分的提取和分離 將采集到的新鮮水皮子蘑菇子實體置于陽光下曝曬干燥,獲得干燥子實體1.02 kg,粉碎,過4目篩,置于5 L的圓底燒瓶中,采用連續(xù)回流的提取方法。依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇各5000 mL,提取溫度分別為65、40、78、65 ℃,連續(xù)回流提取10 h,重復提取3次,合并濾液,減壓回收溶劑,獲得石油醚層浸膏10.03 g,二氯甲烷層浸膏6.30 g,乙酸乙酯層浸膏8.65 g,甲醇層浸膏112.20 g。

對獲得的浸膏采用正向硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜、制備薄層色譜板等方法進行單體化合物的分離。采用濕法裝柱,干法上樣的分離方法,硅膠裝柱量為上樣量的60倍。石油醚浸膏經(jīng)正向硅膠柱色譜,石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(300∶1～1∶1)梯度洗脫,每200 mL收集一個流分,經(jīng)薄層硅膠板檢測,合并相同流分,共得6個流分,其中流分4以石油醚-乙酸乙酯(100∶1～1∶1)洗脫得到化合物1,流分6以石油醚-乙酸乙酯(85∶1～1∶1)梯度洗脫,重結(jié)晶得到化合物2。二氯甲烷浸膏經(jīng)石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(200∶1～1∶1)梯度洗脫,每150 mL收集一個流分,經(jīng)薄層硅膠板檢測,合并相同流分,獲得7個流分,其中流分4以石油醚-乙酸乙酯(70∶1～1∶1)洗脫得到化合物3,流分5經(jīng)過石油醚-乙酸乙酯(60∶1～1∶1-乙酸乙酯)洗脫得到化合物4。乙酸乙酯層浸膏經(jīng)正向硅膠柱,二氯甲烷∶甲醇(150∶1～1∶1)梯度洗脫獲得11個流分,流分9以二氯甲烷-甲醇(85∶1～1∶1)梯度洗脫得到化合物5和6,流分10以二氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脫和制備薄層色譜板分離得到化合物7和8。甲醇層浸膏經(jīng)甲醇溶解后,使用等體積環(huán)己烷萃取,萃取后使用色譜柱以二氯甲烷-甲醇洗脫系統(tǒng)(100∶1～1∶1-甲醇)梯度洗脫得5個流分,其中流分2經(jīng)制備色譜板分離,回收,洗脫,重結(jié)晶得化合物9,流分5以二氯甲烷-甲醇(75∶1～1∶1)梯度洗脫得化合物10。

1.2.2 化學成分的鑒定

1.2.2.1 熔點的測定 采用微量熔點測定法,對所獲得的化合物分別取微量結(jié)晶,置于玻片上并蓋上蓋玻片,放在加熱臺上,調(diào)節(jié)顯微測定儀使顯微鏡焦點對準樣品后,開啟加熱器,控制升溫速度先快后慢,記錄測定所得熔點溫度數(shù)據(jù)[9]。

1.2.2.2 質(zhì)譜分析 取少量待測化合物,分別用甲醇溶解,通過質(zhì)譜儀對其進行分析,進樣量流速設置為120 μL/h,以高純氮氣作為霧化氣和干燥氣,噴霧氣壓力為5 psi,干燥氣流速為5.0 L/min,干燥溫度為220 ℃,質(zhì)荷比范圍設置為50～1000 m/z[10]。

1.2.2.3 核磁共振分析 取適量分離得到的化合物,分別用氘代氯仿溶解后置于核磁管中,使用Bruker-500M AVIII核磁共振波譜儀進行測定,一維氫譜測定條件為500 MHz,一維碳譜測定條件為125 MHz[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用MestReNova 12.0.0對獲得的核磁譜數(shù)據(jù)進行解析。運用ChemDraw Ultra 7.0對得到的化合物繪制化學結(jié)構式。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物中各組分的分離結(jié)果

通過硅膠柱色譜及制備薄層板等分離方法并結(jié)合薄層色譜檢測分析,從石油醚層提取物中分離純化得到化合物1(43 mg)、化合物2(19 mg)。二氯甲烷層提取物中分離純化得到化合物3(21 mg)、化合物4(32 mg)。乙酸乙酯層提取物中分離純化得到化合物5(16 mg)、化合物6(22 mg)、化合物7(35 mg)、化合物8(19 mg)。甲醇層提取物中分離純化得到化合物9(18 mg)、化合物10(20 mg)。

2.2 化合物的結(jié)構鑒定

2.2.1 化合物1的結(jié)構鑒定 具有特殊的芳香氣味,為無色油狀物質(zhì),易溶于乙酸乙酯、乙醇等,EI-MS m/z:277[M]+,分子量為278,分子式為C16H22O4。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.88(6H,t,J=7.1 Hz,H-11,16),1.39(4H,h,J=7.1 Hz,H-9,10),1.70(4H,q,J=7.1 Hz,H-9,14),4.21(4H,t,J=7.1 Hz,H-13,15),7.71(2H,J=1.3 Hz,H-4,5),7.76(2H,ddd,J=7.8,1.3,0.5 Hz,H-3,6);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:167.69(C-7),132.31(C-1),129.39(C-4),129.32(C-3),65.45(C-8),30.64(C-9),19.30(C-10),13.85(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道一致,因此鑒定化合物1為鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate),化學結(jié)構式如圖1。

圖1 化合物1的化學結(jié)構式Fig.1 Chemical structure of compound 1

2.2.2 化合物2的結(jié)構鑒定 白色粉末樣固體,易溶于二氯甲烷、甲醇等,不溶于水,mp:62～64 ℃,EI-MS m/z:256[M]+,分子量為256,分子式為C16H32O2。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,J=6.8 Hz,H-1),1.26(24H,m,H-2～13),1.63(2H,m,H-14),2.34(2H,t,J=7.5 Hz,H-15)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:180.14(C=O),34.06(C-15),31.92(C-3),29.68(C-5),29.66(C-6),29.65(C-7),29.65(C-8),29.63(C-9),29.58(C-10),29.43(C-4),29.35(C-11),29.23(C-12),29.06(C-13),24.68(C-14),22.68(C-2),14.08(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道一致,因此鑒定化合物2為棕櫚酸(Hexadecanoic acid),化學結(jié)構式如圖2。

圖2 化合物2的化學結(jié)構式
Fig.2 Chemical structure of compound 2

2

4

+

28

44

1

3

13

3

圖3 化合物3的化學結(jié)構式Fig.3 Chemical structure of compound 3

2.2.4 化合物4的結(jié)構鑒定 無色針狀結(jié)晶,薄層色譜板用10% H2SO4顯色,顯深綠色,放置3 h后顏色無明顯變化,mp:176～178 ℃,EI-MS m/z:428[M]+,分子量為428,分子式為C28H44O3。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.82(3H,d,J=5.2 Hz,H-27),0.84(3H,d,J=5.2 Hz,H-25),0.86(3H,s,H-18),0.92(3H,d,J=5.2Hz,H-28),0.99(3H,d,J=7.0 Hz,H-23),1.01(3H,s,H-19),3.97(1H,m,H-3),5.21(1H,dd,J=15.4Hz,H-22),5.15(1H,dd,J=15.4Hz,H-23),6.25(1H,d,J=8.2Hz,H-6),6.51(1H,d,J=8.2Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:135.44(C-6),135.20(C-22),132.32(C-23),130.72(C-7),82.17(C-5),79.42(C-8),66.40(C-3),56.22(C-17),51.69(C-14),51.13(C-9),44.57(C-13),42.78(C-24),39.69(C-20),39.36(C-12),36.97(C-4),36.94(C-10),34.71(C-1),33.06(C-25),30.10(C-2),28.62(C-16),23.40(C-11),20.88(C-21),20.63(C-15),19.93(C-27),19.63(C-26),18.16(C-19),17.55(C-28),12.87(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致,因此鑒定化合物4為麥角甾醇過氧化物(Ergosterol peroxide),化學結(jié)構式如圖4。

圖4 化合物4的化學結(jié)構式Fig.4 Chemical structure of compound 4

2.2.5 化合物5的結(jié)構鑒定 白色粉末樣固體,易溶于二氯甲烷、甲醇等,不溶于水,mp:57～61 ℃,EI-MS m/z:284[M]+,分子量為284,分子式為C18H36O2。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,J=6.9 Hz,H-1),1.26(28H,m,H2-15),1.63(2H,m,H-16),2.34(2H,t,J=7.5 Hz,H-17);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:180.45(C-COOH),34.11(C-17),31.93(C-3),29.70(C-5),29.68(C-6),29.67(C-7),29.65(C-8),29.64(C-9,10),29.59(C-11,12),29.43(C-4),29.36(C-13),29.23(C-14),29.06(C-15),24.67(C-16),22.68(C-2),14.07(C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致,故鑒定化合物5為十八烷酸(Searic acid),化學結(jié)構式如圖5。

圖5 化合物5的化學結(jié)構式
Fig.5 Chemical structure of compound 5

+

7

6

2

13

3

圖6 化合物6的化學結(jié)構式Fig.6 Chemical structure of compound 6

2.2.7 化合物7的結(jié)構鑒定 無色針狀結(jié)晶,易溶于甲醇,難溶于石油醚等極性大的溶劑,薄層板在紫外下不顯色,肉眼見無色斑點,mp:132～134 ℃,分子式為CH4N2O。13C NMR(125 MHz,MeOD)δ 162.24。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道一致,因此鑒定化合物7為脲(Urea),化學結(jié)構式如圖7。

圖7 化合物7的化學結(jié)構式Fig.7 Chemical structure of compound 7

2.2.8 化合物8的結(jié)構鑒定 白色粉末,易溶于氯仿,薄層板在紫外燈365 nm下顯現(xiàn)黃綠色斑點,mp:252～254 ℃,EI-MS m/z:433[M]+,分子量為433,分子式為C26H73O3。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.77(3H,s,H-18),0.80(3H,d,J=6.6 Hz,H-27),0.85(3H,d,J=6.6 Hz,H-26),0.88(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),0.96(3H,d,J=6.8 Hz,H-21),1.18(3H,s,H-19),1.67(3H,d,J=1.5 Hz,H-29),2.15(1H,dd,J=12.8,12.1 Hz,H-4),2.39(1H,m,H-20),3.61(1H,m,H-6),3.89(1H,m,H-3),4.97(1H,d,J=1.5 Hz,H-22),5.36(1H,d,J=7.7,2.6 Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:141.64(C-8),134.24(C-23),134.13(C-22),128.15(C-7),75.09(C-5),73.89(C-6),67.40(C-3),56.19(C-17),54.62(C-14),48.00(C-9),44.25(C-12),43.08(C-4),42.43(C-10),42.11(C-20),40.66(C-1),39.03(C-25),33.38(C-2),31.44(C-16),28.28(C-11),27.71(C-15),23.11(C-27),20.41(C-26),20.21(C-21),20.00(C-19),19.17(C-28),17.67(C-29),11.97(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致,因此鑒定化合物8為麥角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(Ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol),化學結(jié)構式如圖8。

圖8 化合物8的化學結(jié)構式Fig.8 Chemical structure of compound 8

2.2.9 化合物9的結(jié)構鑒定 白色晶體,易溶于二氯甲烷,mp:249～251 ℃,EI-MS m/z:442[M]+,分子量為422,分子式為C30H50O2。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.94(1H,s,H-29),3.66(1H,s,H-30),3.48(1H,d,J=3.3 Hz,H-2),2.67(1H,d,J=8.1 Hz,H-19),1.85(2H,t,J=7.6 Hz,H-21),1.26(H,s,H-13),1.58(3H,s,H-28),1.01(3H,s,H-26),0.95(3H,s,H-23),0.86(3H,s,H-25);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:153.18(C-20),114.30(C-29),82.43(C-3),69.27(C-28),59.34(C-5),53.97(C-9),50.94(C-18),50.55(C-19),50.47(C-17),45.83(C-14),44.19(C-4),42.86(C-8),42.36(C-1),40.97(C-13),39.92(C-10),37.71(C-22),35.59(C-7),33.08(C-21),31.62(C-16),30.93(C-23),28.55(C-2),26.40(C-12),23.88(C-15),23.63(C-11),22.63(C-6),21.17(C-25),20.56(C-24),18.87(C-26),15.96(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道一致,因此鑒定化學物9為白樺脂醇(Betulin),化學結(jié)構式如圖9。

圖9 化合物9的化學結(jié)構式Fig.9 Chemical structure of compound 9

2.2.10 化合物10的結(jié)構鑒定 無色針狀晶體,不易溶于石油醚,二氯甲烷等,mp:231～233 ℃,EI-MS m/z:123[M]+,分子量為123,分子式為 C6H5NO2。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:9.08(1H,d,J=1.5 Hz,H-2),8.79(1H,dd,J=4.8,1.7 Hz,H-6),8.27(1H,dt,J=7.9,1.9 Hz,H-4),7.54(1H,m,H-5);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:166.71(C-COOH),153.71(C-2),150.66(C-6),137.41(C-4),127.04(C-3),124.24(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道一致,故鑒定化合物10為3-吡啶甲酸(Nicotinic acid),化學結(jié)構式如圖10。

圖10 化合物10的化學結(jié)構式Fig.10 Chemical structure of compound 10

3 結(jié)論

通過提取、分離及鑒定,從水皮子蘑菇中共得到10個單體化合物,分別為鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸、麥角甾醇、麥角甾醇過氧化物、十八烷酸、苯甲酸、脲、麥角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇、白樺酯醇、3-吡啶甲酸,該10種化合物均為首次從水皮子蘑菇中分離獲得。其中的麥角甾醇、麥角甾醇過氧化物等廣泛存在于大型真菌中,具有較強的抗腫瘤抗氧化作用[22-24],在水皮子蘑菇中的相對含量也較高;白樺脂醇是具有消炎、抗病毒、保肝等作用的天然化合物[25-28],同時具有一定的抗腫瘤作用[29-31]。白樺脂醇在栓菌中較為常見,但在杯傘中的存在較為罕見。此次從水皮子蘑菇中分離獲得白樺脂醇等單體化合物,為水皮子蘑菇進一步進行藥理研究及功能性食品的開發(fā)提供理論基礎。經(jīng)過對水皮子蘑菇化學成分提取分離,對其作為臺蘑的推廣提供理論依據(jù),有助于該食用菌更進一步的開發(fā)利用與深入研究。