肖 蓉，鄧 舒，張春芬，曹秋芬

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹研究所，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030031）

假單胞菌在自然界分布廣泛，其繁殖快、營養(yǎng)要求簡單、定殖能力強(qiáng)，是重要的生防微生物類群[1]。其中，綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）在植物病害生物防治中應(yīng)用廣泛[2-4]。張瑩瑩[5]研究表明，綠針假單胞菌HL5-4 對(duì)番茄灰霉病有抑制作用，同時(shí)還能促進(jìn)番茄的生長。何延靜等[2]在對(duì)甜椒疫霉的防治過程中，分離得到1 株綠針假單胞幽株GP72，其能強(qiáng)烈拮抗辣椒疫霉，對(duì)于瓜果腐霉、水稻紋枯病菌、終極腐霉等也具有良好的拮抗功能，同時(shí)，還能促進(jìn)甜椒生長。楊藝煒[6]分離獲得1 株P(guān)seudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca XF10，其菌懸液與發(fā)酵上清液均能抑制煙草黑脛病菌。MOROHOSHI 等[7]研究表明，從番茄根部獲得的Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 能夠抑制番茄根腐病。JIAO 等[8]研究表明，從小麥根際分離得到1 株P(guān)seudomonas chlororaphis subsp. auran－tiaca Pa40，其能夠抑制10 種植物性病原真菌和6 種植物性病原細(xì)菌。陳亞汶等[9]研究表明，從水稻根際分離得到能夠高產(chǎn)吩嗪-1- 甲酰胺的Pseudomonas chlororaphis HT66，其具有抑菌活性。申順善等[10]從小麥根系中篩選到1 株綠針假單胞菌HG28-5，其對(duì)辣椒疫病具有較高的抑制活性。另外，研究表明，綠針假單胞菌還具有降解芳香化合物的功能。張子間[11]首次分離到1 株可降解石油烴的綠針假單胞菌。

因?yàn)榫G針假單胞菌在病害生物防治、促生及芳香化合物降解方面的突出表現(xiàn)，越來越多的綠針假單胞菌完成全基因組測序。目前，從NCBI 及Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中能查詢到的綠針假單胞菌全基因組序列分別有82 條和73 條。大量基因組數(shù)據(jù)的存在為全面了解綠針假單胞菌菌株特征提供了支撐。TETTELIN 等[12]在 2005 年提出泛基因組（pangenome）的概念，指出所有菌株都攜帶的基因叫核心基因（core gene），只有某些菌株（至少 2 株）攜帶的基因叫非必需基因（dispensable gene），只有一株菌株攜帶的基因叫特有基因（strain-specific gene），核心基因、非必需基因和特有基因共同構(gòu)成了該物種的泛基因組。通過分析核心基因，即可了解該物種的基本生物學(xué)特征；而分析非必需基因和特有基因，則可以了解該物種的各種特定功能，比如與抗病性相關(guān)的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因，與菌株定殖相關(guān)的編碼菌毛結(jié)構(gòu)的基因等。因此，泛基因組分析能夠幫助快速了解一個(gè)物種的基本特征，并理解菌株表型及功能多樣性。

本研究從NCBI 和Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中找到46 株有詳細(xì)分類學(xué)信息且有完整基因組測序信息的綠針假單胞菌，對(duì)這46 株菌進(jìn)行了泛基因組分析，確定其泛基因組特征；利用antiSMASH 軟件對(duì)46 株綠針假單胞菌的次級(jí)代謝基因簇進(jìn)行預(yù)測，挖掘其可能產(chǎn)生的活性物質(zhì)，旨在對(duì)綠針假單胞菌的基因組信息進(jìn)行探索，為全面描述綠針假單胞菌的特征及菌株應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

從 NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）及Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫[13]（https：//www.ezbiocloud.net/）中查找并下載46 株綠針假單胞菌的基因組信息，所有信息均來自2020 年5 月25 日之前的版本。

1.2 方法

1.2.1 基因組平均遺傳相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）分析 使用在線軟件（http：//enve-omics.ce.gatech. edu/g-matrix/）中 的 ANI/AAI matrix[14]對(duì)46 株綠針假單胞菌進(jìn)行基因組平均遺傳相似度分析，研究基因組之間的進(jìn)化距離。

1.2.2 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析 將表1 中菌株對(duì)應(yīng)的fasta 格式基因組數(shù)據(jù)上傳至REALPHY（http：//realphy.unibas.ch/realphy）進(jìn)行全基因組比對(duì)[15]，以Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis DSM_50083 為參考基因組，采用最大似然（ML）算法，使用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行。運(yùn)行結(jié)果使用FigTree v1.4.4 軟件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）重構(gòu)進(jìn)化樹。

1.2.3 泛基因組和核心基因組分析 下載并安裝BPGA 軟件包（https：//sourceforge.net/projects/bpgatool/）[16]，從 NCBI 上獲取 46 株綠針假單胞菌的蛋白質(zhì)序列，輸入蛋白質(zhì)序列，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置對(duì)46個(gè)基因組進(jìn)行泛基因組和核心基因組分析。

1.2.4 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析 利用在線軟件antiSMASH 5.0[1（7]https：//antismash.secondarym etabolites.org）的細(xì)菌分析模塊，選擇relaxed 預(yù)測模式進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，參數(shù)選用網(wǎng)站默認(rèn)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠針假單胞菌基因組基本數(shù)據(jù)分析

從NCBI 和Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中獲得的 46 株組裝到完整基因組水平的綠針假單胞菌基本特征如表1 所示，可以看出，46 株綠針假單胞菌共分為4 個(gè)亞種，分別為Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca、Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens、Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis和Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium；基因組大小在6.61～7.23 Mb，GC 含量為62.0%～63.2%，預(yù)測的基因范圍是5 915～6 432 個(gè)。

2.2 基因組平均遺傳相似度（ANI）分析

ANI 分析是在全基因組水平評(píng)估物種間親緣關(guān)系的有力工具，尤其適合區(qū)分近緣物種?；谌蚪M序列的ANI 比較矩陣圖1 可以看出，除Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis TAMO-ak81 外，其余45 株參考菌株兩兩比較的ANI 值都在95%以上，而95%是大家公認(rèn)的界定同種的閾值。各個(gè)亞種內(nèi)部ANI 值更是高達(dá)100%，這與已知的菌株基本信息相符。Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis TAMOak81 與Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium 的 6 株菌（ATCC17809、ATCC17411、ZJU60、DTR133、PCL1391 和 DSM21509）ANI 值僅為94%，說明TAMOak81 與這6 株菌親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)。

表1 46 株綠針假單胞菌基因組信息

2.3 基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

在REALPHY 在線網(wǎng)站上將46 株綠針假單胞菌基因組進(jìn)行了比對(duì)，去除由重組引起的SNP，然后以Pseudomonas chlororaphis subsp.chlororaphis DSM_50083 為參考基因組，將剩余的SNP 選擇最大似然法，構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2），可見這46 株綠針假單胞菌由4 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的亞群演化而成，Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium ATCC 17809 和ATCC 17411 這2 株菌與其他同亞種菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 核心基因組和泛基因組分析

對(duì)46 株綠針假單胞菌進(jìn)行泛基因組分析，結(jié)果表明，46 株菌共有271 910 個(gè)功能基因，共鑒定出13 296 個(gè)基因家族。從圖3 可以看出，46 株菌共有的核心基因家族有3 653 個(gè)，占綠針假單胞菌泛基因組的27.5%；非必需基因家族有5 675 個(gè)，占綠針假單胞菌泛基因組的42.7%；只有1 株菌株含有的特有基因家族有3 968 個(gè)，占綠針假單胞菌泛基因組的29.8%。Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca B25 的特有基因家族最多，有 484 個(gè)；Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 464 的特有基因家族最少，只有1 個(gè)。

BPGA 分析計(jì)算了綠針假單胞菌基因組數(shù)目、核心基因組和泛基因組之間的關(guān)系（圖4），可以看出，泛基因組大?。╢（x））與基因組數(shù)目（x）關(guān)系的擬合方程為f（x）＝5 171.77x0.2388；核心基因個(gè)數(shù)（f1（x））與基因組數(shù)（x）關(guān)系的擬合方程為 f1（x）＝5 035.38e-0.0073x。根據(jù)擬合方程可以看出，隨著綠針假單胞菌基因組測序數(shù)量的增加泛基因組增加，而核心基因組則逐漸減少。因此，可以推測綠針假單胞菌的泛基因組目前仍然是開放的。

2.5 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測

用AntiSMASH 在線工具識(shí)別和預(yù)測具有編碼次生代謝產(chǎn)物功能的基因簇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物能力較強(qiáng)，每株菌均能預(yù)測到12～17 個(gè)次級(jí)代謝基因簇，基因簇多少與基因組大小無直接相關(guān)性。46 株菌總共預(yù)測到643 個(gè)基因簇，共注釋到27 類，按被注釋到的頻次多少排序可知（圖5），非核糖體肽合成酶（NRPS）出現(xiàn)頻次最高，為120 次；然后依次為細(xì)菌素（bacteriocin，90次），高絲氨酸內(nèi)酯（hserlactone，60 次），芳基多烯（arylpolyene，48 次），NRPS-like（45 次），β 內(nèi)酯（betalactone，43 次），鐵載體（siderophore，42 次）。說明已經(jīng)測序的46 株綠針假單胞菌的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物可能是細(xì)菌素、高絲氨酸內(nèi)酯、芳基多烯和鐵載體類化合物。在全部預(yù)測到的基因簇中，有408 個(gè)與已知基因簇存在一定同源性，其中，同源性大于70%的有35 個(gè)（表2）；同源性為100%的有32 個(gè)，主要是吡咯菌素（pyrrolnitrin）和綠膿菌素（pyocyanine），說明綠針假單胞菌4 個(gè)亞種普遍具有產(chǎn)生吡咯菌素和綠膿菌素的能力。而大量同源性較低的基因簇預(yù)示著綠針假單胞菌中存在大量新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

按亞種分類統(tǒng)計(jì)，綠針假單胞菌4 個(gè)亞種預(yù)測到的次級(jí)代謝基因簇類型數(shù)量分別為Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca 22 類 ，Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 16 類，Pseudomonas chlororaphis subsp. chlororaphis 16 類，Pseudomonas chlororaphis subsp. piscium 15 類。4 個(gè)亞種共同擁有的次級(jí)代謝基因簇類型有10 種，分別為高絲氨酸內(nèi)酯、非核糖體肽合成酶、丁內(nèi)酯（butyrolactone）、細(xì)菌素、鐵載體、β 內(nèi)酯、NRPS-like、芳基多烯、NAGGN 以及吩嗪與高絲氨酸內(nèi)酯雜合基因簇。說明綠針假單胞菌的4 個(gè)亞種均能夠分泌細(xì)菌素、吩嗪、鐵載體、丁內(nèi)酯等。Pseudomonas chlororaphis subsp.aurantiaca 擁有的獨(dú)有次級(jí)代謝基因簇類型比較豐富，有6 個(gè)，包括 ectoine、T1PKS、丁內(nèi)酯等幾個(gè)雜合基因簇。預(yù)示該亞種能夠分泌更多的其他潛在生物活性物質(zhì)。

表2 相似度大于70%的獲注釋已知次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇

3 結(jié)論與討論

本研究在NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得46 株進(jìn)行了全基因組測序并組裝到完整基因組水平的綠針假單胞菌菌株，泛基因組分析發(fā)現(xiàn)，這46 株綠針假單胞菌泛基因組中包含271 910 個(gè)功能基因，共鑒定出13 296 個(gè)基因家族，其中，核心基因家族有3 653 個(gè)、非必需基因家族有5675 個(gè)、特有基因家族有3968 個(gè)。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，隨綠針假單胞菌基因組測序數(shù)量增加泛基因組增加，而核心基因組逐漸減少，說明綠針假單胞菌泛基因組目前仍是開放的。

通過對(duì)46 株綠針假單胞菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌合成次級(jí)代謝產(chǎn)物能力較強(qiáng)，每株菌均能預(yù)測到12～17 個(gè)次級(jí)代謝基因簇。46 株菌總共預(yù)測到643 個(gè)基因簇，共注釋到27 類，其中，4 個(gè)亞種都共同擁有的次級(jí)代謝基因簇類型有10 種，分別為高絲氨酸內(nèi)酯、非核糖體肽合成酶、丁內(nèi)酯（butyrolactone）、細(xì)菌素、鐵載體、β 內(nèi)酯、NRPS-like、芳基多烯、NAGGN 以及吩嗪與高絲氨酸內(nèi)酯雜合基因簇。說明綠針假單胞菌的4 個(gè)亞種均能分泌細(xì)菌素、吩嗪、鐵載體、丁內(nèi)酯等。

目前，已經(jīng)證實(shí)，在假單胞菌中存在的抗生素主要有吩嗪類、藤黃綠菌素（Pyoluteorin）、2，4- 二乙?；g苯三酚（2，4-diacetylphloroglucinol）、氫氰酸（HCN）、粘質(zhì)酰胺（Viscosinamide）和硝吡咯菌素（Pyrrolnitrin）等[18]。黃玲[19]研究指出，綠針假單胞菌GP72 產(chǎn)生的主要抗菌活性物質(zhì)為吩嗪-1- 羧酸（phenazine-1-carboxilic acid，PCA） 和 2- 羥基吩嗪（2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ）。其中，PCA 有效防治甜椒疫病和西瓜炭疽病的作用已經(jīng)得到了國際上的廣泛認(rèn)可，并且其作為新型農(nóng)藥申嗪霉素的主要成分，已經(jīng)申請(qǐng)了專利。PIERETTI 等[20]從番茄根分離到Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens M71，能夠產(chǎn)生 2 種吩嗪類物質(zhì)。CARLIER 等[21]從大豆根際分離到Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca SR1 能產(chǎn)生鐵載體、HCN 和激素類物質(zhì)；JIAO 等[8]研究表明，從小麥根際分離得到Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca Pa40 能夠產(chǎn)生HCN、蛋白酶、鐵載體；張瑩瑩等[5]研究表明，綠針假單胞菌HL5-4 能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和嗜鐵素；楊藝煒[6]研究發(fā)現(xiàn)，綠針假單胞菌XF10 能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶和5 種有抑菌作用的揮發(fā)性酮類產(chǎn)物（2- 壬酮、2- 壬醇、2- 癸酮、2- 十一烷酮、2-十三烷酮）；熊欣等[22]、CHEN 等[23]研究表明，生防綠針假單胞菌HT66 的主要代謝產(chǎn)物為吩嗪-1- 甲酰胺，此外，HT66 還可合成鐵載體、殺蟲蛋白Fit D（Pseudomonas fluorescens insecticidal toxin D）、HCN、Achromobactin（Acr）和脂肽類產(chǎn)物黏液菌素等產(chǎn)物。大量研究已證實(shí)，綠針假單胞菌確實(shí)有產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物的功能，這些次生代謝產(chǎn)物在抑制病原菌、促進(jìn)植物生長、幫助菌株定殖、菌株的運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成和代謝等方面發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，46 株綠針假單胞菌中存在大量同源性較低的基因簇，預(yù)示著綠針假單胞菌中有大量新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其還有待進(jìn)一步深入挖掘。

本研究對(duì)46 株綠針假單胞菌完整基因組分析發(fā)現(xiàn)，其泛基因組含有271 910 個(gè)功能基因，13 296 個(gè)基因家族，其中，核心基因家族有3 653 個(gè)，特有基因家族有3 968 個(gè)。次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測顯示，共挖掘到27 類、643 個(gè)基因簇，其中，4 個(gè)亞種都共同擁有的次級(jí)代謝基因簇類型有10 種；綠針假單胞菌中還有大量未開發(fā)的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在植物抗病、促生等方面有巨大的應(yīng)用潛力。