束安梅，高雨嫣，朱逸暉，王 威，許惠琴，杜 秋，陳 璟，呂高虹，盧金福

(南京中醫(yī)藥大學藥學院, 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室, 江蘇 南京 210023)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，病理表現(xiàn)為腎小球肥大、基底膜增厚、細胞外基質(zhì)積聚，是終末期腎病的主要致死原因[1]。新近研究顯示[2]，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)誘導的炎癥反應在DN進程中扮演著重要角色。巨噬細胞是調(diào)節(jié)腎臟炎性反應的關(guān)鍵炎癥細胞，其會隨著不同微環(huán)境極化為M1或M2型，其中M1型巨噬細胞通過分泌大量的炎性因子IL-6、IL-12和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等促進炎癥反應[3]，M2型巨噬細胞分泌IL-10抑制炎癥反應和促進組織修復[4]。腎小球內(nèi)皮細胞作為主要的腎臟固有細胞，不僅是腎損傷的受害者，也是主動參與者[5]。AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞分泌單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor，M-CSF)和細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等[6]，激活、促進巨噬細胞向腎臟趨化，加重糖尿病腎臟炎性損傷。

梓醇(catalpol，Cat)是從中藥地黃的塊根中提取的一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有降血糖、抗炎和抗氧化應激等作用[7]。研究顯示[8]，Cat能夠減少AGEs誘導的單核細胞炎癥因子的分泌，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的轉(zhuǎn)位，從而抑制AGEs介導的炎癥。Cat可有效降低DN小鼠的血糖、升高血清胰島素水平，改善腎臟的病理改變，減輕對腎臟固有細胞的損傷[9]。本實驗旨在通過建立腎內(nèi)皮細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)模型，觀察Cat對AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞介導巨噬細胞活化的抑制作用，為探索糖尿病慢性炎癥的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株小鼠腎小球內(nèi)皮細胞(mouse glomerular endothelial cells，MGECs)，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，編號：BNCC340482；小鼠巨噬細胞(RAW264.7)，南京中醫(yī)藥大學藥理實驗室惠贈。

1.2 藥物與試劑Cat標準品，成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：Z-005-190523；氨基胍(aminoguanidine，Ami)，美國Sigma公司，批號：079K1734V；高糖DMEM、Trypsin-EDTA、胎牛血清，美國Gibco公司，批號：AD17497268、42F1190K、25200-056；RIPA細胞裂解液、Triton X-100、DAPI染液，Solarbio公司；MCP-1、M-CSF、TNF-α、IL-12 ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：201906；iNOS、CD206、ICAM-1、Arg-1抗體，Abcam公司；CD16/32抗體，Affinity公司；β-actin抗體，Bioworld公司；FITC-羊抗兔IgG，Boster公司；Anti-rabbit IgG，美國CST公司。

1.3 儀器二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國GE公司；自動細胞計數(shù)儀，美國Countstar公司；垂直凝膠電泳儀，美國BIO-RAD公司；Ti型熒光顯微鏡，日本Nikon公司；高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司；3413、3422、3450 Transwell細胞培養(yǎng)皿，美國Corning公司。

2 方法

2.1 AGEs的制備將牛血清白蛋白(BSA，50 g·L-1)與葡萄糖(0.5 mol·L-1)充分溶解于PBS緩沖液(pH 7.4)，37 ℃避光孵育4個月，使其形成AGEs-BSA溶液(即AGEs)。同時在平行條件下配制不含葡萄糖的BSA溶液，即無糖基化的0-BSA作為陰性對照。將孵育好的AGEs裝在孔徑為分子量1萬的透析袋中，置于PBS緩沖液(0.01 mol·L-1)中4 ℃低溫透析24 h以除去未反應的葡萄糖，使用0.22 μm微孔濾器過濾以除去溶液中的細菌。BCA蛋白定量法測定AGEs濃度為20.1 g·L-1。

2.2 細胞培養(yǎng)MGECs和RAW264.7用含胎牛血清(體積分數(shù)占0.10)及青鏈霉素混合液(體積分數(shù)占0.01)的高糖DMEM置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。

2.3 ELISA法檢測細胞上清液中MCP-1、M-CSF、IL-12、TNF-α的分泌取對數(shù)生長期的MGECs用培養(yǎng)液調(diào)整至1×108個·L-1，每孔1 mL種于24孔板，另取RAW264.7調(diào)整至2×107個·L-1，每孔0.5 mL種于0.4 μm的Transwell小室內(nèi)，于培養(yǎng)箱孵育至細胞貼壁融合后，更換不含胎牛血清的高糖DMEM饑餓培養(yǎng)12 h。將細胞分為空白組、模型組、Ami組(終濃度為10.0 μmol·L-1)、Cat組(終濃度為1.0、10.0 μmol·L-1)，每組設5個復孔。加入各藥物預孵1 h后，用AGEs(終濃度為200 mg·L-1)刺激MGECs，并將Transwell小室移至接種MGECs的24孔板上方共培養(yǎng)48 h。吸取小室中RAW264.7上清液和24孔板內(nèi)MGECs上清液，用ELISA試劑盒分別檢測MCP-1、M-CSF和IL-12、TNF-α水平。

2.4 結(jié)晶紫染色法觀察巨噬細胞的遷移調(diào)整MGECs至2×108個·L-1，每孔2 mL種于6孔板，調(diào)整RAW264.7至4×107個·L-1，每孔1 mL種于0.8 μm的Transwell小室內(nèi)。分組和給藥同上述“2.3”項，每組設3個復孔。取出小室并吸除培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦去上層小室的RAW264.7，加入多聚甲醛室溫固定30 min后用PBS洗3次，滴加結(jié)晶紫染色30 min，置于顯微鏡下觀察單位視野下穿透膜的巨噬細胞數(shù)量。

2.5 免疫熒光法檢測巨噬細胞標記蛋白iNOS和CD206的表達將細胞專用爬片置于Transwell小室中央，MGECs調(diào)整至2×108個·L-1，每孔2 mL種于6孔板，RAW264.7調(diào)整至4×107個· L-1，每孔0.5 mL種于0.4 μm的Transwell小室爬片。分組和給藥同上述“2.3”項，每組設3個復孔。用事先預冷的PBS小心沖洗玻片3次，多聚甲醛室溫固定15 min，PBS沖洗玻片3次。用Triton X-100室溫通透20 min后，PBS沖洗3次，每次3 min。滴加100 μL山羊血清室溫封閉1 h，吸除封閉液，每片滴加100 μL一抗4 ℃過夜。次日每片滴加100 μL熒光二抗，37 ℃避光孵育2 h。PBS沖洗3次，加入DAPI避光染核5 min，PBS清洗4次后，吸去玻片上殘余液體，置于熒光顯微鏡下觀察。

2.6 Western blot法檢測ICAM-1、iNOS、CD16/32、CD206、Arg-1蛋白表達調(diào)整MGECs至2×108個·L-1，每孔2 mL種于6孔板，調(diào)整RAW264.7至4×107個·L-1，每孔1 mL種于0.4 μm的Transwell小室內(nèi)。分組和給藥同上述“2.3”項，每組設3個復孔。吸去培養(yǎng)液，用事先預冷的PBS分別將RAW264.7和MGECs吹打混懸，置于EP管中離心后收集細胞，加入RIPA細胞裂解液提取蛋白，用BCA蛋白含量試劑盒測定濃度。蛋白樣品按體積加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液，95 ℃煮5 min后備用。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入BSA(0.5 g·L-1)室溫封閉2 h后，加一抗4 ℃孵育過夜。次日用PBST洗膜4次，每次15 min。加二抗室溫孵育2 h后，再用PBST洗膜4次，每次15 min，ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參對照，利用ImageJ軟件分析各組條帶灰度值并進行計算定量。

3 結(jié)果

3.1 Cat對AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞表達MCP-1、M-CSF、ICAM-1的影響與空白組相比，模型組AGEs明顯提高MGECs的MCP-1、M-CSF分泌水平(P<0.01)(Fig 1)和ICAM-1蛋白表達水平(P<0.01)(Fig 2)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度抑制其表達(P<0.05，P<0.01)，且10.0 μmol·L-1濃度Cat抑制MCP-1、M-CSF分泌和降低ICAM-1蛋白表達的效果相對更好(P<0.01)。

3.2 Cat對AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞介導巨噬細胞分泌IL-12、TNF-ɑ的影響與空白組相比，模型組AGEs明顯升高MGECs介導RAW264.7分泌IL-12、TNF-α(P<0.01)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度抑制其分泌(P<0.05，P<0.01)，見Fig 3。

3.3 Cat對AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞介導巨噬細胞遷移的影響與空白組相比，AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞介導共培養(yǎng)下的巨噬細胞明顯向腎內(nèi)皮細胞遷移(P<0.01)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度抑制其遷移(P<0.01)，見Fig 4。

Fig 1 Effect of catalpol on level of MCP-1, M-CSF in MGECs induced by AGEs n=5)##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Mode

Fig 2 Effect of catalpol on expression of ICAM-1 in MGECs induced by AGEs n=3)##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Model

Fig 3 Effect of catalpol on level of IL-12, TNF-α in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=5)##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Model

Fig 4 Effect of catalpol on migration in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)##P<0.01 vs Control；**P<0.01 vs Model

3.4 Cat對AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞介導巨噬細胞M1型極化標記蛋白iNOS、CD16/32的影響免疫熒光結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組AGEs明顯增強MGECs介導RAW264.7 M1型標記蛋白iNOS的熒光強度(P<0.01)，加入Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)干預其熒光強度減弱(P<0.05，P<0.01)，且10.0 μmol·L-1濃度Cat減弱iNOS熒光強度相對更好(P<0.01),見Fig 5。

Fig 5 Effect of catalpol on fluorescence expression of iNOS in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)##P<0.01 vs Control；*P<0.05,**P<0.01 vs Model

Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組AGEs明顯上調(diào)MGECs介導RAW264.7 M1型標記蛋白iNOS、CD16/32的表達(P<0.01)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可不同程度下調(diào)其表達(P<0.05，P<0.01)，且10.0 μmol·L-1濃度Cat下調(diào)iNOS、CD16/32蛋白表達的作用相對更好(P<0.01)，見Fig 6。

Fig 6 Effect of catalpol on expression of iNOS and CD16/32 in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)1:Control; 2:Model; 3:Ami; 4:Catalpol 1.0 μmol·L-1; 5:Catalpol 10.0 μmol·L-1. ##P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs Model

3.5 Cat對AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞介導巨噬細胞M2型極化標記蛋白CD206、Arg-1的影響免疫熒光結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組AGEs減弱MGECs介導RAW264.7 M2型標記蛋白CD206的熒光強度(P<0.05)，加入Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)干預可明顯增強其熒光強度(P<0.01),見Fig 7。

Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組AGEs下調(diào)MGECs介導RAW264.7 M2型標記蛋白CD206、Arg-1的表達(P<0.05)，而Ami(10.0 μmol·L-1)、Cat(1.0、10.0 μmol·L-1)可明顯上調(diào)其表達(P<0.01)，見Fig 8。

Fig 8 Effect of catalpol on expression of CD206 and Arg-1 in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)1:Control; 2:Model; 3:Ami; 4:Catalpol 1.0 μmol·L-1; 5: Catalpol 10.0 μmol·L-1. #P<0.05 vs Control; **P<0.01 vs Model

Fig 7 Effect of catalpol on fluorescence expression of CD206 in RAW264.7 mediated by AGEs-stimulated MGECs n=3)#P<0.05 vs Control; **P<0.01 vs Model

4 討論

隨著人民生活水平的提高和飲食習慣的改變，近年來DN發(fā)病率迅速增加。在DN進程中，以巨噬細胞炎性浸潤為代表的低水平炎癥持續(xù)存在。對DN患者各時期的腎組織活檢發(fā)現(xiàn)，在腎小球和腎小管間質(zhì)均可見巨噬細胞炎性浸潤，其浸潤數(shù)量與腎小球硬化、腎纖維化程度呈正相關(guān)[10]。并且，腎組織中浸潤的巨噬細胞存在明顯的表型比例失衡，促炎的M1型巨噬細胞占大多數(shù)，通過改變巨噬細胞M1/M2的比例可明顯減輕腎損傷[11]。

在生理狀態(tài)下，巨噬細胞在器官組織中的數(shù)量極少，其遷移和功能調(diào)控均有精密機制[12]。但當糖尿病環(huán)境中的高糖、多元醇和AGEs等刺激腎臟時，血管內(nèi)皮細胞受損，血管通透性增加，同時內(nèi)皮細胞分泌大量的MCP-1、M-CSF和ICAM-1等，進而募集血液中的單核細胞黏附，浸潤入腎臟組織活化為巨噬細胞。MCP-1是β趨化因子亞家族成員，可以促進巨噬細胞募集、遷移和極化。研究表明[13]，MCP-1的抑制作用與血流動力學無關(guān)，主要是通過抑制巨噬細胞的M1型極化和減弱肝素酶對糖原體的降解來降低大鼠蛋白尿。ICAM-1是免疫球蛋白超家族中的一種細胞表面糖蛋白，在DN早期即可檢測到腎組織內(nèi)ICAM-1的高表達，ICAM-1與巨噬細胞表面的配體LFA-1結(jié)合后，促進巨噬細胞黏附，介導巨噬細胞的遷移過程。對糖尿病ICAM-1基因敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1的缺失會使蛋白尿明顯降低，伴隨著腎臟中巨噬細胞的累積明顯減少[14]。M-CSF是巨噬細胞存活、增殖和分化的一個主要調(diào)節(jié)因子，其調(diào)節(jié)巨噬細胞釋放炎癥因子如IL-12、IL-1β、TNF-α等，一方面直接導致腎臟損傷，如血管內(nèi)皮細胞泡沫化、足細胞足突廣泛融合、系膜細胞增生等[15]；另一方面，又繼續(xù)增強巨噬細胞的募集、活化，擴大炎癥反應，形成惡性循環(huán)。

巨噬細胞向腎組織的遷移、極化，以及炎癥因子的釋放均會造成腎臟的損傷。因此，阻斷巨噬細胞的活化途徑，可能是預防和治療糖尿病腎病的有效策略。本實驗建立了腎內(nèi)皮細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)模型，AGEs刺激腎內(nèi)皮細胞后，趨化因子MCP-1和黏附分子ICAM-1表達增加，從而促進巨噬細胞向腎內(nèi)皮細胞遷移，且巨噬細胞M1型標記蛋白iNOS、CD16/32表達升高、M2型標記蛋白CD206、Arg-1表達降低；同時腎內(nèi)皮細胞M-CSF的高表達，使巨噬細胞分泌大量的炎性因子IL-12、TNF-α，而加入Cat預保護后再經(jīng)AGEs刺激可明顯減緩此效應。這表明Cat可通過減少腎內(nèi)皮細胞分泌趨化因子MCP-1、M-CSF和黏附分子ICAM-1，抑制巨噬細胞遷移和炎性因子分泌，調(diào)節(jié)巨噬細胞M1/M2極化平衡，從而減輕炎癥反應，延緩糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展，但其具體作用機制有待進一步深入研究。