王 坤，胡才彪,章 成，秦志強(qiáng)，周蘭蘭

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽 合肥 230032；2. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)學(xué)院，廣東 深圳 518055)

疼痛(pain)一直困擾著人類，一氧化氮/環(huán)磷酸鳥苷/蛋白激酶G(NO/cGMP/PKG)是體內(nèi)參與痛覺(jué)中樞傳遞作用的重要蛋白通路[1]， NO/cGMP/PKG通路的激活能使抑制劑受體磷酸化(如γ-氨基丁酸)而降低其疼痛抑制作用，脊髓興奮性氨基酸釋放增加導(dǎo)致繼發(fā)性痛覺(jué)過(guò)敏，同時(shí)促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，繼而引發(fā)一系列胞內(nèi)過(guò)程。不同來(lái)源以及不同氧化還原狀態(tài)的一氧化氮(nitric oxide，NO)可能具有神經(jīng)元保護(hù)或者損害作用，而過(guò)量NO可能通過(guò)各種機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，iNOS和nNOS活性神經(jīng)元主要位于L3-L5脊髓段的背角側(cè)和中央管周圍[4]。nNOS在脊髓內(nèi)表達(dá)上調(diào)受iNOS調(diào)節(jié)，可能是維持小鼠慢性周圍神經(jīng)病理性疼痛的重要因素[5]。我們前期結(jié)果及其他研究均表明，cGMP依賴的蛋白激酶PKGI在傷害性感受鏈的發(fā)育及脊髓痛覺(jué)過(guò)敏機(jī)制中是發(fā)揮cGMP功能作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6-7]。鞘內(nèi)注射NOS抑制劑(例如L-NAME和L-NMMA)抑制NO合成，或直接敲除NO或抑制cGMP合成，均可減少神經(jīng)性疼痛的傷害感受行為[5,8]。

雞矢藤環(huán)烯醚萜苷(iridiod glycosides from Paederia scandens，IGPS)是從茜草科植物雞矢藤中提取的一類有效活性成分，主要有效成分包括雞矢藤苷、雞矢藤次苷、車葉草苷等。IGPS是GRA公認(rèn)安全的具有有效治療作用的植物成分之一[9]。課題組前期研究結(jié)果顯示，IGPS在小鼠福爾馬林試驗(yàn)、扭體試驗(yàn)、坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型等均顯示良好鎮(zhèn)痛活性，且無(wú)成癮性[6,10]。本文采用NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)誘導(dǎo)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元傷害模型，進(jìn)一步研究IGPS抑制NO-CGMP/PKG信號(hào)、保護(hù)新生大鼠神經(jīng)元的作用。另外，為排除直接在離體培養(yǎng)細(xì)胞加中藥提取物的可能影響，本研究采用了在藥理學(xué)中經(jīng)有效驗(yàn)證的血清藥理學(xué)方法制備IGPS含藥血清。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑IGPS由安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室提供，棕黃色粉末，臨用時(shí)用蒸餾水配制，批號(hào)151120。SNP(431451，Sigma 公司)；兔抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，BA0535，BOTER 公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、NO含量和NOS活性測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建城生物工程研究所；cGMP試劑盒購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)核試驗(yàn)室；Revert AidTMFirst Strand cDNA synehesis Kit (00033699，F(xiàn)ermentas公司)；PCR MasterMix (17304，北京天根公司)；Fluo-3,AM(F026，DOJINDO Laboratories)。

1.2 動(dòng)物♂SD大鼠，體質(zhì)量200±20 g，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第 01 號(hào))。實(shí)驗(yàn)前給予動(dòng)物至少3 d適應(yīng)周期。于溫度(22～24)℃、相對(duì)濕度(60±5)%，及12 ∶12 h明暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。

1.3 新生大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元純化、培養(yǎng)及神經(jīng)元特異性烯醇化酶免疫組化鑒定無(wú)菌條件下取新生大鼠脊神經(jīng)節(jié)， Collagenase-Dispase在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱消化，加入MEM-F12培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿提前用多聚賴氨酸和層粘連蛋白包被處理，離心得到單細(xì)胞懸液以1×108個(gè)·L-1密度接種于培養(yǎng)皿，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)1周。取出培養(yǎng)板，用2%多聚甲醛(含0.3% Triton X-100)室溫固定30 min，加1 ∶100 NSE，加1 ∶200生物素化山羊抗兔IgG。使用DAB顯色試劑盒，依次經(jīng)梯度濃度乙醇脫水、透明、封片，于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，同一視野下計(jì)數(shù)染色的陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)量之比，即為神經(jīng)元細(xì)胞純度。

1.4 IGPS含藥血清制備♂SD大鼠40只，飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分組：正常對(duì)照組，IGPS(70、140、280 mg·kg-1)組，灌胃給藥，連續(xù)3 d，每日2次。最后1次灌胃1 h后于大鼠腹主動(dòng)脈采血，4 ℃靜置過(guò)夜，2 000 r·min-1離心25 min，取上層血清，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)除菌，56 ℃水浴滅活，-20 ℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 SNP致DRG神經(jīng)元損傷模型制備、MTT法測(cè)定細(xì)胞活力及IGPS含藥血清的處理DRG細(xì)胞培養(yǎng)72 h，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和IGPS含藥血清組(280、140、70 mg·kg-1)。模型組及用藥組均用200 μmol·L-1SNP溶液灌注預(yù)處理30 min，然后各藥物組加入由正常細(xì)胞培養(yǎng)基1 ∶8稀釋的IGPS含藥血清100 μL。并設(shè)置調(diào)零組(只加培養(yǎng)基和藥物且不含DRG細(xì)胞)和陰性對(duì)照組(培養(yǎng)孔內(nèi)含DRG細(xì)胞的同時(shí)加入培養(yǎng)基和空白血清)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，所有組別DRG細(xì)胞處理后分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入MTT(終濃度 0.5 g·L-1)， 置于培養(yǎng)箱37 ℃、5% CO2孵育 4 h，加入DMSO(150 μL/孔)，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A 值)。

1.6 DRG神經(jīng)元cGMP/PKG信號(hào)通路指標(biāo)測(cè)定

1.6.1NO和cGMP含量測(cè)定、iNOS活性測(cè)定 新生大鼠DRG神經(jīng)元培養(yǎng) 72 h，建立SNP模型及用含藥血清處理后，提取總蛋白，使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。采用分光光度計(jì)法測(cè)定NO含量和iNOS活性，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用放射免疫法測(cè)定cGMP含量，數(shù)據(jù)由Gamma放射免疫測(cè)定儀(UstcZonkia GC-1500)記錄。

1.6.2RT-PCR測(cè)定iNOSmRNA，PKGIAαmRNA和PKGIβmRNA 使用TRIzol試劑從培養(yǎng)DRG細(xì)胞提取總RNA及純度鑒定，引物設(shè)計(jì)如下表所示：

GenePrimerSequence(5'-3')BasepairiNOSForwardAGAGAAGGGCGCGTTGTGGTAGTT506bpReverseTGTCAGATGGCAAGGGTTCAGGTGPKGIαForwardCTTCTTCGCCAACCTG369bpReverseGGCAAACGCTTCTACCAPKGIβForwardGGGCTCATTCCGATTT363bpReverseTCATGGCCTTTGTTCAGβ-actinForwardATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC606bpReverseAGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG

兩步法進(jìn)行cDNA合成，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，分別取上述cDNA 10 μL與iNOS等或β-actin引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，按試劑盒說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行。

使用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR混合物進(jìn)行分析，并通過(guò)凝膠記錄系統(tǒng)(Biosens SC810，中國(guó)上海)對(duì)圖像進(jìn)行采集。產(chǎn)物相對(duì)含量用電泳條帶信號(hào)灰度值與β-actin電泳條帶信號(hào)灰度值之比表示。

1.7 DRG神經(jīng)元熒光染色及胞漿游離Ca2+濃度測(cè)定Fluo-3/AM儲(chǔ)備液(5 μmol fluo-3，AM, 0.005% Pluronic F-127, 0.1% DMSO)，-80 ℃避光保存，使用前解凍。培養(yǎng)皿滴入0.2 mL Fluo-3，AM預(yù)知液，正常培養(yǎng)箱孵育1 h。去除染液，緩沖液沖洗。培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5，德國(guó)萊卡公司)載物臺(tái)上，記錄連續(xù)動(dòng)態(tài)掃描的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度(FT)變化。Fluo-3，AM在波長(zhǎng)488 nm處激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm，采樣頻率為488 HZ，每皿選3～5個(gè)視野，以FT變化反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化。

2 結(jié)果

2.1 新生大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)，純度測(cè)定及染色鑒定剛接種的DRG細(xì)胞呈圓形，明亮且分散(Fig 1A),4～6 h后開(kāi)始貼壁。接種24 h后，大部分貼壁細(xì)胞開(kāi)始長(zhǎng)出突起，并可觀察到突起末端的生長(zhǎng)錐。孵育3～5 d后，細(xì)胞之間開(kāi)始形成網(wǎng)絡(luò)(Fig 1B)。用NSE抗體對(duì)新生小鼠原代培養(yǎng)DRG神經(jīng)元進(jìn)行免疫染色，NSE 主要在胞質(zhì)中表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量居多，呈深棕色，細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形以及多邊形等，偶爾可觀察到突起伸出(Fig 1C，1D)。鑒定結(jié)果顯示，培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元細(xì)胞純度達(dá)0.9以上。

Fig 1 Culture and identification of DRG neuronsA.DRG neurons cultured for 1 h (×1 000); B. DRG neurons cultured for 24 h (×200); C and D. DRG neurons identified by NSE immunohistochemistry (DAB×400)

2.2 SNP 對(duì)DRG神經(jīng)元的損傷作用及IGPS含藥血清的調(diào)節(jié)與對(duì)照組相比，SNP模型組DRG細(xì)胞的存活率為 57.73%，顯示 SNP處理對(duì)DRG神經(jīng)元造成了損傷(P<0.01)。而與 SNP模型組相比，IGPS 含藥血清(140、280 mg·kg-1)組大鼠 DRG 神經(jīng)元存活率呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)，Tab 1。

Tab 1 Effect of IGPS-containing serum on survival in

2.3 SNP誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元NO/cGMP/PKG信號(hào)通路變化及IGPS含藥血清的調(diào)節(jié)作用與對(duì)照組相比，用NO供體SNP預(yù)處理30 min可以明顯增加亞硝酸鹽水平并增強(qiáng)iNOS酶活性，而IGPS含藥血清(280、140、70 mg·kg-1)的干預(yù)呈濃度依賴性地抑制亞硝酸鹽水平以及iNOS活性的升高(Fig 2A)。cGMP定量顯示了一致的結(jié)果，200 μmol·L-1終濃度的SNP溶液可以明顯升高cGMP含量，而IGPS含藥血清可以明顯下調(diào)cGMP含量(Fig 2B)。

Fig 2 NO production modulated by IGPSA: NO production and iNOS activity; B: cGMP level. ##P<0.01, vs control. *P<0.05, **P<0.01 vs SNP.

2.4 SNP對(duì)DRG神經(jīng)元iNOS，PKGIα和PKGIβ mRNA的表達(dá)的影響及IGPS含藥血清的調(diào)節(jié)作用Fig 3A，B結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SNP促進(jìn)了DRG神經(jīng)元iNOS mRNA，PKGIα和PKGIβ mRNA的表達(dá)。與模型組相比，IGPS含藥血清可明顯下調(diào)受損DGR神經(jīng)元iNOS mRNA(P<0.01，P<0.05)，PKGIα mRNA(P<0.05，P<0.05)和PKGIβ mRNA(P<0.01，P<0.05)的過(guò)度表達(dá)。

2.5 SNP對(duì)DGR神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響及IGPS含藥血清的調(diào)節(jié)作用與對(duì)照組相比，SNP作用DRG 神經(jīng)元Ca2+濃度在15 s處有明顯上升。對(duì)照組DRG 神經(jīng)元Ca2+水平在55 s 內(nèi)幾乎沒(méi)有變化(Fig 4A)。與對(duì)照組相比，SNP誘導(dǎo)DRG神經(jīng)元的Fluo-3，AM熒光強(qiáng)度(103.936±16.945)遠(yuǎn)高于對(duì)照組神經(jīng)元(20.896±9.471)，差異有顯著性(P<0.01)。 與SNP模型組相比，DRG神經(jīng)元升高的Ca2+水平IGPS含藥血清可以明顯下調(diào)，差異有顯著性(P<0.01,P<0.05)(Fig 4B)。

Fig 4 Intracellular Ca2+ variations in DRG neurons regulated by IGPSA: Effect of IGPS containing serum on time course of Ca2+ formation; B: The mean intensity of intracellular Ca2+concentration. Data represents mean±SEM of at least eight individual experiments. ##P<0.01 vs control, *P<0.05, **P<0.01 vs SNP

Fig 3 mRNA expression of iNOS, PKGΙα and PKGIβ decreased by IGPSA: Representative RT-PCR image of mRNA expressions of iNOS, PKGΙ (α, β); B: Relative ratios of iNOS, PKGΙ (α, β) to β-actin, respectively. ##P<0.01, vs control, *P<0.05, **P<0.01 vs SNP

3 討論

NO作為信息傳遞分子參與體內(nèi)多種生理病理過(guò)程，研究證實(shí)，過(guò)量NO可對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生毒性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用SNP作為NO供體提高DRG細(xì)胞內(nèi)NO濃度，結(jié)果顯示SNP在200 μmol·L-1濃度時(shí)，細(xì)胞存活率在50%左右，選擇此濃度為造模濃度最適合。IGPS為中藥提取物，采取中藥血清藥理學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法，從細(xì)胞水平探討中藥的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGPS含藥血清可明顯提高NO損傷后神經(jīng)元的存活率，提示IGPS含藥血清對(duì)SNP損傷DRG細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

研究證實(shí)，cGMP依賴性的PKG酶參與了脊髓的疼痛傳遞，當(dāng)外周神經(jīng)受損出現(xiàn)炎癥可引起外周PKGI激活并逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至DRG神經(jīng)元中，致使脊髓PKGI表達(dá)量增加[11]。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IGPS的鎮(zhèn)痛作用可能與NO介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。IGPS含藥血清可明顯抑制DRG神經(jīng)元細(xì)胞NO和cGMP含量， 可明顯下調(diào)PKGI(α,β)mRNA表達(dá)，即IGPS可通過(guò)抑制PKG介導(dǎo)的NO/cGMP信號(hào)通路的磷酸化發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。N型和L型電壓門控的Ca2+通道阻滯劑可有效緩解與神經(jīng)性疼痛相關(guān)的痛覺(jué)過(guò)敏和異常性疼痛，不影響正常痛覺(jué)。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IGPS可以明顯降低由外源NO引起的鈣離子濃度升高，這表明誘導(dǎo)炎癥性和神經(jīng)性疼痛可能需要鈣依賴的突觸后機(jī)制。

綜上，研究結(jié)果表明，IGPS含藥血清可通過(guò)抑制NO誘導(dǎo)的cGMP/PKG 信號(hào)通路及升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，有效降低SNP損傷DRG神經(jīng)元的死亡率而產(chǎn)生保護(hù)作用。