屈孟錦，李雪松，滕巧泱，李魯兆，劉性坡，崔宏銳，楊健美，李澤君

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H9N2亞型禽流感（avian influenza，AI）在世界范圍內(nèi)廣泛存在，給養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和人類健康帶來嚴重危害[1]。自1994年首次報道在我國雞群中分離到H9N2禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）[2]以來，該病毒在我國已流行20多年，幾乎所有的養(yǎng)殖場都有該亞型AIV的存在。H9N2 AIV也可以感染哺乳動物，包括豬和人類，自1999年首次從人體中分離到H9N2流感病毒后，隨后又在廣東、云南等地從人體分離到了該病毒[3-6]。H9N2 AIV還會與其他亞型流感病毒發(fā)生重組，如近些年引起社會恐慌的H7N9禽流感病毒，其內(nèi)部基因就是由H9N2禽流感病毒提供的[7]。由此可見，H9N2 AIV造成的危害不容忽視。

AIV由8個基因組成，其中血凝素（hemagglutinin，HA）是AIV的主要抗原，變異頻率很高[8]，其變異會導致AIV抗原變異。Li等[9]發(fā)現(xiàn)1996-2002年間中國大陸地區(qū)的H9N2 AIV可分為6個抗原群，不同抗原群之間抗原差異較大；Teng等[10]發(fā)現(xiàn)2009-2012年在中國分離的H9N2 AIV已經(jīng)形成新的抗原亞組，與中國早期的H9N2分離株抗原性不同，其流行毒株與疫苗株之間存在抗原差異，從而可造成免疫失敗引發(fā)疫情。

近年來，單克隆抗體廣泛應用在流感病毒抗原變異的研究中，Wan等[11]采用抗H9N2 AIV HA的單抗在雞胚中篩選逃逸突變病毒，并從中鑒定出9個關(guān)鍵氨基酸，這對于H9抗原圖譜的繪制具有重要意義。Chen等[12]通過中和抗體篩選逃逸突變株的方法，發(fā)現(xiàn)8種抗H1N1亞型HA單克隆抗體識別HA抗原表位的Sa、Sb、Ca1和Ca2位點。氨基酸的變異可能會導致抗原性的變異，通過單克隆抗體來標記HA的抗原位點對抗原變異的研究以及疫苗的研制具有重要意義。

前期實驗利用表達H9N2 AIV SH441毒株HA基因的真核表達質(zhì)粒免疫小鼠已獲得多株抗H9亞型HA蛋白的單克隆抗體，本研究在此基礎(chǔ)上，成功篩選到4株抗H9亞型HA的廣譜中和抗體1F2、1C5、3F7和4E7（本文未列出其他不具有廣譜性的單克隆抗體），這些單克隆抗體將為H9N2 AIV通用疫苗研制及高通量抗體檢測方法的建立提供重要材料。

1 材料和方法

1.1 主要材料Phanta高保真酶、同源重組酶購自Vazyme公司；膠回收試劑盒購自Axygen公司；EcoR I和XhoI限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；DH5α感受態(tài)細胞購自擎科生物公司；去內(nèi)毒素中提質(zhì)粒試劑盒購自QIAGEN公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自Biosun公司；Opti-MEM購自Gibco公司；TransIT-293 Transfection Reagent購自Mirus Bio LLC公司；羊抗鼠FITC標記的IgG購自Thermo Fisher公司；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒、質(zhì)粒、載體和細胞A/Chicken/Shanghai/441/2009(H9N2)(Ck/SH/441/2009)、A/Chicken/Jiangsu/825/2009(H9N2)(Ck/JS/825/2009)、A/Chicken/Jiangsu/925/2009(H9N2)(Ck/JS/925/2009)、A/Chicken/Jiangsu/A139/2010(H9N2)(Ck/JS/A139/2010)、A/Chicken/Shandong/2612/2010(H9N2)(Ck/SD/2612/2010)、A/Chicken/Anhui/B278/2011(H9N2)(Ck/AH/B278/2011)、A/Chicken/Guangdong/B527/2011(H9N2)(Ck/GD/B527/2011)、A/Duck/Anhui/C313/2012(H9N2)(Dk/AH/C313/2012)、A/Chicken/Guangdong/C76/2012(H9N2)(Ck/GD/C76/2012)、A/Chicken/Guangdong/D1389/2013(H9N2)(Ck/GD/D1389/2013)、A/Chicken/Anhui/D483/2013(H9N2)(Ck/AH/D483/2013)、A/Chicken /Henan/E3203/2014(H9N2)(Ck/HN/E3203/2014)、A/Chicken/Guangdong/F1650/2015(H9N2)(Ck/GD/F1650/2015)，質(zhì)粒pCAGGS-H9、pCAGGS-H9N1SH5，pCAGGS空載體，293T細胞、MDCK細胞均由本實驗室提供。

1.3 引物設(shè)計參照實驗室前期測得的序列，通過Primer Primier 5.0軟件設(shè)計各片段擴增所需引物（表1），在需要融合的片段上加入至少15 bp的重疊序列。同源重組引物在相應的位置加上至少15 bp的載體序列，以將其連接在載體上。

1.4 雞胚中和實驗用空白細胞培養(yǎng)液將SH441毒株稀釋成200 EID50/100 μL，稀釋好的病毒分別與單克隆抗體以及空白細胞培養(yǎng)液等量混和，充分混勻后37℃作用2 h；將混合液接入9～11日齡SPF雞胚，每組3個雞胚，每個雞胚接種100 μL；37℃溫箱孵育48 h后取尿囊液進行血凝實驗。陽性血凝結(jié)果則表示病毒未被抗體中和，陰性血凝結(jié)果則表示病毒被抗體中和。

表1 各片段PCR擴增引物Table 1 Primers for every fragment

1.5 血凝抑制實驗選擇近年分離到的13株H9N2 AIV毒株，將毒株配制成8單位抗原，隨后在血凝板加入25 μL/孔 PBS，第一列依次加入25 μL單克隆抗體細胞上清液，充分混勻后吸取25 μL于第2列，按照此方法2倍比稀釋至第10列后吸取25 μL棄去。血凝板的前11列均加入25 μL已配制準確的8單位抗原，混勻室溫作用30 min后，加入50 μL/孔0.5%雞紅細胞懸液，輕輕混勻，靜置30 min后讀數(shù)，以完全抑制8單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI效價。以不具有廣譜性的單克隆抗體10F3作為對照。

1.6 間接免疫熒光實驗將MDCK細胞以合適的比例鋪勻至24孔板中，待長至80%～90%時棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS清洗1次后備用；將13株H9N2毒株用無血清培養(yǎng)基2000倍稀釋接種在洗滌過的MDCK細胞中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去細胞上清液，固定、通透、封閉后，將單克隆抗體和羊抗鼠FITC37℃作用1 h，每次均用PBS洗滌3次；最后使用熒光顯微鏡觀察并拍照。以不具有廣譜性的單克隆抗體10F3作為對照。

1.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建pCAGGS-H9是將H9亞型優(yōu)化的SH441毒株的HA片段插入到真核表達載體pCAGGS β-actin啟動子的下游；pCAGGS-H9N1 SH5是將優(yōu)化的SH441毒株的HA片段和N1亞型的NA片段依次插入到真核表達載體Huang4 β-actin啟動子下游，H5亞型HA片段插入到SV40啟動子下游。以pCAGGS-H9N1SH5為模板分別擴增H9和H5；再以H9為模板擴增H9HA1和H9HA2，同理得到H5HA1和H5HA2；隨后通過引物PCS-H9HA1-F和PCS-H5HA2-R將H9HA1和H5HA2融合成1個片段H9HA1-H5HA2，同理得到片段H5HA1-H9HA2。將融合得到的2個片段通過同源重組反應與酶切純化過的pCAGGS載體連接重組；隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，菌液PCR鑒定陽性的菌液進行測序，測序正確的菌液通過去內(nèi)毒素中提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組基因結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant gene structure

1.8 間接免疫熒光檢測單克隆抗體作用區(qū)域利用293-Mirus轉(zhuǎn)染試劑將2個HA重組嵌合質(zhì)粒pCAGGS-H9HA1-H5HA2、pCAGGS-H5HA1-H9HA2分別轉(zhuǎn)染至生長密度為80%～90%的293T細胞，并且轉(zhuǎn)染pCAGGS-H9作為陽性對照，pCAGGS空質(zhì)粒作為空白對照，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后做間接免疫熒光實驗，使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 中和實驗結(jié)果將單克隆抗體1F2、1C5、3F7和4E7與SH441病毒的混合液接種雞胚，48 h后取尿囊液經(jīng)血凝實驗測定均沒有血凝現(xiàn)象，空白培養(yǎng)液與SH441病毒的混合液存在血凝現(xiàn)象，且血凝價為211，結(jié)果與SH441病毒自身的血凝價相同，說明這4株單克隆抗體對于SH441病毒均存在中和活性。

2.2 血凝抑制實驗結(jié)果通過血凝抑制實驗檢測單克隆抗體對不同H9N2 AIV的反應性，結(jié)果見表2。其中1F2、1C5、3F7和4E7對這13株2009-2015年間分離到的H9N2 AIV都具有較強的反應性，而10F3與2009年的毒株反應性較強，與2009年以后的毒株反應逐漸減弱。

表2 單克隆抗體與不同H9N2亞型禽流感病毒血凝抑制交叉反應結(jié)果Table 2 The HI results of different H9N2 AIV against MAbs

2.3 間接免疫熒光實驗結(jié)果通過間接免疫實驗檢測不同的H9N2 AIV感染MDCK細胞后與單克隆抗體的反應性，1F2、1C5、3F7和4E7對這13株毒株均可見明顯的綠色熒光，其中1F2、1C5、3F7和4E7與SH441毒株反應結(jié)果見圖2。10F3與2009年的毒株反應可見明顯的熒光，與2009年后的毒株反應熒光較弱，甚至沒有熒光（表3）。

2.4 重組質(zhì)粒的鑒定以構(gòu)建質(zhì)粒為模板，使用引物對PCS-H9HA1-F和PCS-H5HA2-R擴增H9HA1-H5HA2，引物對PCS-H5HA1-F和PCS-H9HA2-R擴增H5HA1-H9HA2，1%瓊脂糖電泳檢測，均擴增出約1700 bp的特異性條帶，與預期大小一致（圖3）。將質(zhì)粒測序，測序結(jié)果經(jīng)比對與預期一致。

圖2 4株單克隆抗體在MDCK細胞上與SH441毒株反應的IFA結(jié)果Fig.2 The IFA results of MAbs against SH441 virus in MDCK cells

2.5 間接免疫熒光檢測單克隆抗體作用區(qū)域結(jié)果結(jié)果見表4，1F2、1C5、3F7和4E7均與pCAGGSH9HA1-H5HA2和pCAGGS-H9反應，有明顯的綠色熒光，而與pCAGGS-H5HA1-H9HA2和pCAGGS空質(zhì)粒都不反應，這說明1F2、1C5、3F7和4E7作用位點都位于HA1區(qū)域。

表3 單克隆抗體與不同H9N2亞型禽流感病毒間接免疫熒光實驗結(jié)果Table 3 The IFA results of different H9N2 AIV against MAbs

圖3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig. 3 Identification of recombinant plasmids by PCR

表4 單克隆抗體與HA重組質(zhì)粒IFA結(jié)果Table 4 The IFA results of MAbs with HA recombinant plasmids

3 討論

本研究中選擇了13株2009-2015年間不同地域分離到的H9N2 AIV，HA基因皆屬于Ck/BJ/1/1994分支下的Subgroup Ⅱ亞分支，彼此抗原性存在差異。HI和IFA實驗表明，10F3與2009年毒株具有較強反應性，與2009年以后毒株反應性逐漸減弱，說明其識別的是一個易變異的表位，這13株毒株的抗原性在不斷的發(fā)生變化；而1F2、1C5、3F7和4E7與這些毒株都具有較強的反應性，說明這4株單克隆抗體具有廣譜反應性，其識別的可能是一個保守表位。

本研究構(gòu)建了H9亞型與H5亞型HA的嵌合質(zhì)粒，目的是為了檢測單克隆抗體的作用位點是位于HA1或者HA2亞基，結(jié)果顯示這5株單克隆抗體位于HA1亞基。在流感病毒感染或者疫苗免疫的過程中，引發(fā)體液免疫產(chǎn)生的抗體通常針對HA的頭部對機體產(chǎn)生保護，但是這類抗體普遍具有毒株特異性；另一類抗體針對HA莖部保守區(qū)域，可以阻止不同亞型的流感病毒[13-14]，有研究報道，相較于針對HA頭部和受體結(jié)合區(qū)域的抗體，流感病毒更難逃逸針對莖部的廣譜抗體[15]。

總之，本研究篩選到4株廣譜具有中和活性抗H9亞型HA的單克隆抗體，且其作用位點在HA1區(qū)域，這些單克隆抗體將為H9N2 AIV通用疫苗研制及高通量抗體檢測方法的建立提供重要材料。