高 飛，姜一峰，李國新，張玉嬌，虞凌雪，周艷君，李麗薇，鄭海紅，童光志

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心揚(yáng)州大學(xué)，揚(yáng)州 225009）

豬瘟（classical swine fever，CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），是臨床上危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[1-4]，尤其是2006年暴發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（highlypathogenic PRRS，HPRRS）。這兩種疫病都是“國家中長期動(dòng)物疫病防控規(guī)劃（2012-2020年）”中優(yōu)先防治的一類動(dòng)物疫病。致病病原體分別為豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）。為了有效預(yù)防和控制這兩種疫病在我國的流行和蔓延，我們基于HP-PRRSV的弱毒疫苗株的反向遺傳操作平臺(tái)[5]，利用PRRSV基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（transcriptional regulatory sequence，TRS）調(diào)控亞基因組非連續(xù)性轉(zhuǎn)錄的特性[6-7]開展了表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗（rPRRSV-E2）的研究。前期研究表明，rPRRSV-E2基因工程疫苗免疫豬體1次后能夠?yàn)镠PPRRS和CSF提供100%的免疫保護(hù)，是一種非常有前途的基因工程疫苗候選株[8]。本研究對(duì)rPRRSV-E2在豬體的留存和排毒能力，及其在豬群中的水平傳播能力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 疫苗與細(xì)胞表達(dá)豬瘟E2蛋白的重組豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因工程疫苗候選株（rPRRSV-E2）第5代細(xì)胞毒，病毒滴度106.5TCID50/mL。MARC-145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)15頭35日齡PRRS抗原/抗體陰性的健康仔豬，按105.0TCID50/頭的劑量肌肉注射接種rPRRSV-E2第5代細(xì)胞毒，每隔7 d隨機(jī)采集血清、鼻拭子和糞便樣品各10份，用PRRSV real-time PCR[9]檢測(cè)病毒，持續(xù)3個(gè)月。同時(shí)，將5頭PRRS抗原/抗體陰性的相同日齡健康仔豬與10頭免疫豬只混養(yǎng)，每隔7 d采集血清樣品進(jìn)行PRRS抗原和抗體檢測(cè)。所有豬只在試驗(yàn)期間每天觀察臨床表現(xiàn)，并定期測(cè)體溫，記錄數(shù)值。

1.3 樣品采集對(duì)試驗(yàn)豬只逐頭采集血液樣品與拭子樣品。用注射器于前腔靜脈采集血液5 mL，3000×g離心10 min，將分離的血清分裝做好標(biāo)記用于后期的檢測(cè)。用棉簽刮取豬鼻腔深處、肛門部位樣品，取樣后將棉簽置于2 mLPBS中，振蕩混勻，3000×g離心10 min取上清液分裝做好標(biāo)記用于后期的檢測(cè)。

1.4 抗原和抗體檢測(cè)使用IDEXX 公司生產(chǎn)的PRRS和CSF的抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)血清中PRRSV和CSFV的抗體進(jìn)行檢測(cè)。用PRRSV熒光定量PCR方法對(duì)血清和拭子中的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)；用實(shí)驗(yàn)室建立的PRRSV ORF5和E2基因檢測(cè)方法對(duì)未分離到病毒的細(xì)胞上清液進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)用引物見表1。

1.5 病毒分離取生長良好的MARC-145細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入采集的血清樣品，50 μL/孔，每個(gè)樣品重組2孔。37℃吸附1 h，棄去血清樣品，PBS洗滌1次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，200 μL/孔。置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，每日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect,CPE）并做好記錄。

1.6 病理學(xué)觀察待試驗(yàn)結(jié)束，撲殺所有試驗(yàn)豬只并剖檢，觀察和記錄各組織臟器的大體病變，并采集病死豬的肺臟、脾臟、腎臟、心臟、肝臟、扁桃體、淋巴結(jié)、腦、胃和小腸組織，用10%中性福爾馬林固定后按常規(guī)加工方法制作病理切片，觀察組織病理學(xué)變化[8,10]。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀3組試驗(yàn)仔豬在試驗(yàn)觀察期內(nèi)生長正常，無發(fā)燒、厭食、精神沉郁、跛行等臨床癥狀。rPRRSV-E2免疫組、同居感染觀察組和陰性對(duì)照組（Mock組）之前臨床癥狀表現(xiàn)無顯著差異。各試驗(yàn)組體溫變化見圖1。

2.2 血清中病毒含量變化情況免疫組豬只在免疫后第7 d血清中病毒含量呈陽性，持續(xù)至免疫后第28 d，從免疫后第28 d直至試驗(yàn)結(jié)束均未在血清中檢測(cè)到病毒，結(jié)果見圖2。對(duì)28 d后拷貝數(shù)超過陰性對(duì)照的血清樣品進(jìn)行病毒分離，均未能分離到病毒。所有血清樣品中病毒抗原檢測(cè)為陰性。

2.3 血清抗體水平變化情況分析免疫豬只PRRSV和CSFV的抗體自免疫后14 d全部轉(zhuǎn)為陽性，PRRSV在免疫后28 d到達(dá)峰值（圖3A），CSFV在免疫后第35 d到達(dá)峰值（圖3B），之后持續(xù)維持在一個(gè)較高的水平至試驗(yàn)結(jié)束；同居感染觀察組豬只（B組）和陰性對(duì)照組（Mock組）在試驗(yàn)期間血清中兩種抗體均為陰性（圖3B）。對(duì)免疫組血清樣品的CSFV中和效價(jià)進(jìn)行了測(cè)定，免疫組豬只血清樣品中CSFV中和抗體水平在rPRRSV-E2免疫后持續(xù)上升，在免疫后35 d中和效價(jià)能夠達(dá)到1∶1024。直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，中和抗體的效價(jià)一直能維持在1∶1000的水平。B組和C組均為陰性（圖3C）。

表1 熒光定量RT-PCR使用引物序列Table 1 Oligonucleotides used for RT-qPCR

圖1 rPRRSV-E2免疫后各組豬只體溫變化情況Fig.1 Body temperature curve of pigs in each group after rPRRSV-E2 immunization

圖2 rPRRSV-E2免疫后豬只血清中病毒含量檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of virus load in swine serum samples after rPRRSV-E2 immunization

圖3 rPRRSV-E2免疫后血清抗體水平變化情況分析Fig.3 Antibody changes in serum samples after rPRRSV-E2 immunization in test groups

2.4 鼻拭子和肛拭子中病毒含量變化情況對(duì)所有試驗(yàn)組的豬只鼻拭子和肛拭子樣品利用本試驗(yàn)室建立的方法進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。rPRRSV-E2免疫組及其同居感染觀察組中拭子樣品和空白對(duì)照組相比，病毒拷貝數(shù)均較低，無顯著差異（圖4）。對(duì)其中病毒拷貝數(shù)略高于陰性對(duì)照的樣品進(jìn)行病毒分離，在MARc-145細(xì)胞上進(jìn)行傳代，觀察細(xì)胞病變及IFA熒光結(jié)果，結(jié)果顯示，免疫組豬只從免疫開始至試驗(yàn)結(jié)束，均未從拭子中分離到PRRSV。

圖4 rPRRSV-E2免疫后豬只鼻拭子和肛拭子中病毒含量檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of viral load in swine nasal and anus swab samples after rPRRSV-E2 immunization

2.5 病理學(xué)檢查結(jié)果將試驗(yàn)豬只于免疫后3個(gè)月剖殺檢查，免疫組與同居感染組及陰性對(duì)照組試驗(yàn)豬的肺臟、脾臟、腎臟、肝臟、心臟、扁桃體和淋巴結(jié)眼觀無明顯病理變化，且3組間無顯著差異；對(duì)肺臟進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)正常、清晰，3組間無顯著差異，未見間質(zhì)性肺炎的病理損傷，結(jié)果見表2。

3 討論

臨床上，使用弱毒活疫苗免疫接種是我國對(duì)于CSF和HP-PRRS采用的最主要的防控手段。因此，HP-PRRS和CSF的兩種疫苗均被廣泛應(yīng)用于豬場的豬只免疫中，但是豬場多種疫苗同時(shí)使用以及高頻次的免疫接種，增加了豬只的免疫負(fù)擔(dān)，還經(jīng)常發(fā)生不同的疫苗相互干擾，這都會(huì)影響疫苗的免疫效力，很難獲得較好的免疫效果。因此，本團(tuán)隊(duì)利用反向遺傳技術(shù)，研發(fā)了表達(dá)CSFV E2蛋白的重組PRRSV基因工程疫苗rPRRSV-E2。目前該疫苗前期研究表明，其能夠?qū)P-PRRSV和CSFV提供完全的免疫保護(hù)。另外，母源抗體干擾試驗(yàn)的初步結(jié)果表明，rPRRSV-E2不受PRRSV和CSFV母源抗體的干擾。

表2 各試驗(yàn)組剖檢病理學(xué)變化Table 2 Pathological examination of piglets in different groups

對(duì)于弱毒活疫苗來說，毒株安全性是疫苗的第一重要指標(biāo)，除了采用安全性檢驗(yàn)和毒力返強(qiáng)試驗(yàn)來評(píng)估外，疫苗病毒的水平傳播能力也可作為安全性評(píng)估的重要依據(jù)[11-12]。任何事物都具有兩面性，疫苗病毒的水平傳播也是這樣，疫苗病毒水平傳播可以彌補(bǔ)疫苗免疫接種遺漏的問題，使整群動(dòng)物均獲得免疫保護(hù)能力，但疫苗病毒如果較長時(shí)間在動(dòng)物間傳播，會(huì)增加毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)[10,13-14]。

因此，本研究中開展了rPRRSV-E2的水平傳播試驗(yàn)，結(jié)果表明rPRRSV-E2免疫的豬群不會(huì)向外界排毒，不能在豬群間水平傳播，具有良好的安全性。表達(dá)CSFV E2蛋白的重組PRRSV基因工程疫苗候選株rPRRSV-E2不僅可達(dá)到“一針防兩病”的效果，對(duì)于CSF來說，rPRRSV-E2還是一種DIVA（differentation between infected and vaccinated animals）疫苗[15-18]。免疫后，可以通過CSFV Erns抗體檢測(cè)試劑盒與野毒CSFV感染進(jìn)行血清學(xué)的鑒別診斷，將有利于我國豬群中CSFV的控制和凈化。綜上所述，rPRRSV-E2的成功研發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。