張 帥，譚菲菲，王 妍，宋歡歡，李向東，王同燕，田克恭

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450000；2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽 471003）

兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）屬于杯狀病毒科兔病毒屬，是一種能夠引起兔出血性疾?。╮abbit hemorrhagic disease，RHD）的單鏈RNA病毒[1]。該病毒粒子含有7.9 kb的基因組（genomic RNA，gRNA）及2.2 kb亞基因組(subgenomic RNA，sgRNA)，具有兩個相互交叉的開放閱讀框（open reading frames，ORFs），其中ORF1編碼的多聚蛋白，被切割成主要的結(jié)構(gòu)衣殼蛋白VP60以及解旋酶、RNA依賴性RNA聚合酶、蛋白酶等非結(jié)構(gòu)蛋白；ORF2編碼一種小型結(jié)構(gòu)蛋白VP10。在病毒顆粒中也發(fā)現(xiàn)了同時編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP60和VP10的亞基因組mRNA[2]。該病毒最早于1984年在中國被首次報道[3]，隨后在世界各地流行，目前在多個國家流行[4-7]。該病毒具有兩個血清型，所有致病株病毒屬于同一血清型，包含RHDV和RHDVa兩個亞型，對兔子具有較高的致死率[8-10]。

由于RHDV缺乏合適的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，目前RHDV的防控主要依靠組織滅活疫苗，雖然能夠為現(xiàn)行流行毒株提供免疫保護，但是存在外源感染、成本難控、動物福利等問題，因此，開發(fā)一種安全、廉價、有效的亞單位疫苗對RHDV的防控具有十分重要的意義。VP60蛋白形成的病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs）能夠與成人“O”型紅細(xì)胞表面的糖脂配體結(jié)合發(fā)生凝集（hemagglutinin，HA）反應(yīng)[11]，免疫兔子后具有較好的免疫原性與反應(yīng)原性[9,12]，是RHDV診斷和疫苗設(shè)計的主要抗原蛋白[13]。桿狀病毒表達系統(tǒng)（baculovirus expression system，BVES）生產(chǎn)的重組VP60蛋白具有良好的生物活性，但由于VP60蛋白糖基化水平較高，而昆蟲細(xì)胞糖基化修飾效率較低，導(dǎo)致BVES生產(chǎn)重組VP60蛋白產(chǎn)量不高，難以滿足實際應(yīng)用的需要。

為提高VP60蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達量，本研究在供體質(zhì)粒水平上利用桿狀病毒基因組中的同源重復(fù)增強子（homologous region enhancer，Hr）Hr1、Hr3、土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element，WPRE）、哺乳動物早期啟動子SV40以及由巨細(xì)胞病毒（the cytomegalovirus，CMV）早期增強子（early enhancer element）和雞β-肌動蛋白（chicken beta-actin）形成的組合型啟動子CAG等順式作用元件及元件組合對pFastBacDual供體質(zhì)粒進行改造；在目的基因水平通過添加蜂毒素信號肽（honeybee melittin signal peptide，Melt）序列對VP60基因進行優(yōu)化；旨在獲得對重組VP60蛋白具有優(yōu)化作用的改造類型，為RHDV基因工程亞單位疫苗的低成本開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞pFastBacDual質(zhì)粒、pCAGGS質(zhì)粒、DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞、sf9細(xì)胞由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.2 主要試劑Prime STAR? HS DNA Polymerase、BacPAK? Baculovirus Rapid Titer Kit 購自寶日醫(yī)生物；質(zhì)粒提取試劑盒、2×TaqPCR預(yù)混試劑Ⅱ購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA Bio-Tek試劑公司；PageRuler?Prestained Protein ladder、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠綠色熒光二抗購自賽默飛世爾科技有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Kit試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；Cellfectin? II Reagent購自gibco公司；Insect-XPRESS無蛋白昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自lonza公司；NC膜購自生工生物工程（上海）股份有限公司；DAB Kit購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)胞瓶、細(xì)胞板購自康寧公司；RHDV多抗血清、RHDV VP60鼠源單克隆抗體為國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備保存；基因、引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 1%人O型紅細(xì)胞配制采集狀況良好人“O”型全血與等體積阿氏液混合，4℃保存過夜后使用。用pH 7.0、0.015 mol/L PBS洗滌，200×g離心5 min至紅細(xì)胞上清無溶血，用PBS配制成體積比為1%紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因的擴增根據(jù)中RHDV毒株RED1-2013（GenBank登錄號：KY679903.1）的VP60氨基酸序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司優(yōu)化合成昆蟲細(xì)胞密碼子偏好的基因序列[14]。以合成基因為模板，用相應(yīng)的引物對（表1）擴增獲得BamHIMelt-VP60-EcoRI、BamHI-VP60-EcoRI、SmaIMelt-VP60-PaeI、SmaI-VP60-PaeI基因片段，按照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit說明書進行基因克隆，挑選鑒定正確的克隆送測序。桿狀病毒基因組（GenBank登錄號：NC_001623.1）中同源增強子Hr1、Hr3；WPRE轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（GenBank登錄號：HW158052.1）；SV40早期啟動子（參照pACGFP-C1質(zhì)粒序列）由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；CAG組合啟動子以pCAGGS質(zhì)粒為模板PCR擴增得到，按照pEASY-Blunt Simple Cloning Kit說明書進行基因克隆，挑選鑒定正確的克隆送測序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 pFastBacDual供體質(zhì)粒的改造通過人工基因合成、分子克隆等手段將Hr1、Hr3、SV40、CAG、WPRE等順式作用元件及元件組合整合到pFastBacDual供體質(zhì)粒，獲得了11種改造供體質(zhì)粒。將優(yōu)化后擴增的VP60基因、Melt-VP60基因片段插入到pFastBacDual及改造后的供體質(zhì)粒中，共獲得15種含有VP60基因的供體質(zhì)粒（圖1），酶切鑒定正確后送金唯智測序。

1.6 重組Bacmid的鑒定與抽提將100～300 ng測序正確的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，通過3種抗性（卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素）篩選及藍(lán)白斑篩選，挑選白色單克隆菌落，使用BacM13F、BacM13R進行菌落PCR鑒定，篩選陽性單克隆菌落，使用卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素抗性液體LB培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。使用天根質(zhì)粒抽提試劑盒中的P1、P2、P3抽提重組Bacmid，分光光度計測定Bacmid濃度及純度。

1.7 重組桿狀病毒的拯救與鑒定選擇D260/280值在1.8～2.0，濃度不低于500 ng/μL的重組Bacmid，按照Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑的說明書轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后每24 h觀察1次細(xì)胞狀態(tài)，與正常sf9細(xì)胞對比，直至出現(xiàn)細(xì)胞核增大、細(xì)胞停止生長、胞內(nèi)出現(xiàn)小泡，收集上清液，命名為Ac-改造類型-RHDV-VP60，標(biāo)記為P1代。按照體積比1∶100在25T細(xì)胞瓶中盲傳2代，P3代按照1∶100體積比在搖瓶中進行懸浮培養(yǎng)獲得P4代病毒。P3、P4代重組桿狀病毒表達的重組VP60蛋白使用1%人“O”型紅細(xì)胞測定HA活性。

1.8 重組桿狀病毒滴度測定96孔細(xì)胞板接種6.5×104個/孔sf9細(xì)胞制備單層細(xì)胞。將P4代重組桿狀病毒梯度稀釋后，每孔接種稀釋后病毒液25 μL，27℃恒溫培養(yǎng)箱吸附1 h后，吸棄病毒液加入50 μL甲基纖維素，27℃濕盒內(nèi)培養(yǎng)43～47 h。4%多聚甲醛進行固定后，使用GP64鼠源單克隆抗體作為一抗，羊抗鼠HRP作為二抗，通過過氧化物底物顯色，在光學(xué)顯微鏡下觀察最高稀釋度孔內(nèi)藍(lán)斑數(shù)量，數(shù)量在5～25時較為合理，如果不在此范圍內(nèi)，觀察其余稀釋度孔內(nèi)藍(lán)斑數(shù)量。滴度計算公式：病毒滴度（IFU/mL）=平均藍(lán)斑數(shù)量×稀釋度的倒數(shù)×40。

圖1 VP60基因在pFastBacDual供體質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of VP60 gene insertion pFastBacDual donor plasmid

1.9 間接免疫熒光（indirect immunofluorescrence assay，IFA）檢測重組蛋白24孔細(xì)胞板按照2.5×105個/孔接種Sf9細(xì)胞，P4代重組桿狀病毒按照MOI=2接毒，27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，使用RHDV VP60鼠源單抗隆抗體1∶500倍稀釋作為一抗，羊抗鼠IgG綠色熒光抗體1∶500倍稀釋作為二抗，熒光顯微鏡下觀察熒光，判定重組VP60蛋白的反應(yīng)原性。

1.10 SDS-PAGE鑒定重組VP60蛋白P4代rAc-RHDV-VP60按照MOI=2在搖瓶中傳代P5代，接毒96 h后收獲重組桿狀病毒，4℃條件下，100×g離心10 min，取等量上清液培養(yǎng)物用于SDS-PAGE電泳鑒定重組VP60蛋白表達情況。

1.11 Western blot鑒定重組VP60蛋白重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至NC膜上，使用5%脫脂牛奶封閉1 h后，RHDV多抗血清按照1∶1000使用5%脫脂牛奶稀釋作為一抗孵育1 h，PBST洗脫（5 min/次），HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 1∶5000作為二抗孵育1 h，PBST洗脫3次（5 min/次）后，使用康為世紀(jì)DAB顯色試劑盒避光顯色1 min，ddH2O清洗NC膜終止顯色后封閉保存，觀察顯色狀況預(yù)判重組VP60蛋白與單克隆抗體反應(yīng)情況。

1.12 HA試驗在96孔V型微量反應(yīng)板中加入25 μL/孔0.015 mol/L的PBS（pH7.0），吸取25 μL上清液培養(yǎng)物加入第1孔，混勻；從第1孔吸取25 μL混合液加入第2孔混勻，依次倍比稀釋，最后1孔棄去25 μL混合液，留作空白對照，懸空加入25 μL/孔的1%人“O”型紅細(xì)胞懸液，輕輕震蕩均勻，室溫靜置45 min后觀察結(jié)果。在空白對照成立的條件下，以50%出現(xiàn)凝集的最高稀釋倍數(shù)為HA效價。測定HA效價，通過log2△HA效價來反應(yīng)不同改造類型對重組VP60蛋白表達量的影響?！鱨og2HA=log2試驗組HA-log2對照組HA。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒滴度測定結(jié)果P4代重組桿狀病毒滴度結(jié)果顯示：rAc-Hr3-RHDV-VP60、rAc-Hr3-WPRE-Melt-RHDV-VP60、rAc-SV40-WPREMelt-RHDV-VP60試驗組病毒滴度高于rAc-PFBDRHDV-VP60對照組，表明Hr3、Hr3-WPRE-Melt、SV40-WPRE-Melt對重組桿狀病毒滴度提升具有促進作用；rAc-WPRE-RHDV-VP60、rAc-CAGRHDV-VP60、rAc-Hr3-Hr1-RHDV-VP60試驗組病毒滴度低于對照組，表明WPRE、CAG 以及Hr3-Hr1組合不利于重組桿狀病毒增殖；其他試驗組病毒滴度與對照組差異不顯著（表2）。

表2 15種改造的重組桿狀病毒滴度測定結(jié)果Table 2 Titer measurement results of 15 modified recombinant baculovirus strains

2.2 IFA鑒定重組VP60蛋白IFA鑒定結(jié)果（圖2） 可知，試驗組產(chǎn)生明顯高于野毒對照和細(xì)胞對照的特異性熒光，表明獲得的所有重組桿狀病毒均能夠表達重組VP60蛋白；表達的重組VP60蛋白能夠與VP60單克隆抗體反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性；順式作用元件及信號肽的插入不影響重組VP60蛋白的反應(yīng)原性。

2.3 SDS-PAGE與Western blot鑒定重組VP60蛋白不同構(gòu)建方式獲得的重組桿狀病毒在55 kDa～72 kDa處均有條帶（圖3A），大小與預(yù)期蛋白大?。?0 kDa）一致，表明不同優(yōu)化方式獲得的重組桿狀病毒均能夠表達VP60蛋白，與IFA鑒定結(jié)果一致；Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPRE-Melt試驗組蛋白條帶強于Ac-PFBD-RHDV-VP60對照組，表明以上改造方式對重組VP60蛋白表達具有促進作用；WPRE、CAG、Hr3-WPRE-Melt、SV40-Hr3-Melt試驗組蛋白條帶與對照組相比較弱，表明以上改造方式對重組VP60蛋白的表達無增強作用。Western blot鑒定結(jié)果可知（圖3B），所有改造類型獲得的重組VP60蛋白均能夠與RHDV的多克隆抗體血清反應(yīng)，表明重組VP60蛋白在昆蟲細(xì)胞內(nèi)獲得了正確表達，具有良好反應(yīng)原性；與對照組相比，Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE改造類型蛋白產(chǎn)量相對較高；SV40-Hr3-Melt改造類型免疫印跡條帶不明顯，這可能與該類型獲得重組VP60蛋白產(chǎn)量較低有關(guān)。

2.4 HA試驗鑒定重組RHDVVP60蛋白 所有構(gòu)建類型獲得重組VP60蛋白均能夠與人“O”型紅細(xì)胞發(fā)生HA反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性；試驗組與rAc-PFBD-RHDV-VP60對照組相比，重組VP60蛋白的HA效價變化見表3。Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPREMelt改造類型對重組VP60蛋白的表達具有提高作用，其中Hr3、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40、SV40-WPRE改造類型能夠提高重組VP60蛋白HA效價8～16倍；WPRE、CAG、SV40-Hr3-Melt改造類型降低了重組VP60蛋白的HA效價；CAG-WPRE、Hr1-Hr3、SV40-Hr3改造類型對VP60的HA效價無影響。Melt信號肽不利于重組VP60蛋白的表達量的提升；單一的CAG、WPRE元件對重組VP60蛋白表達無提升作用，WPRE與Hr1、Hr3、SV40元件組合使用對重組VP60蛋白的表達具有疊加增強作用，但Hr3-Hr1、SV40-Hr3元件疊加使用不利于重組VP60蛋白的表達（表3）。

圖2 重組VP60蛋白的IFA分析Fig.2 IFA analysis of recombinant VP60 protein

3 討論

RHD是一種能夠?qū)Ｒ桓腥就米?，引起兔子急性肝壞死、多器官出血等癥狀的烈性傳染病，具有極高的死亡率，給兔肉及皮毛產(chǎn)業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失，嚴(yán)重危害世界家兔養(yǎng)殖[15-17]。由于RHDV無法進行細(xì)胞培養(yǎng)，目前RHDV防控主要依賴于兔肝組織滅活疫苗，但因為組織滅活疫苗存在滅活不完全、外源感染等生物安全風(fēng)險且生產(chǎn)成本較高、不符合動物倫理要求，所以開發(fā)安全高效的新型疫苗對RHDV防控具有十分重要的意義。VP60蛋白是RHDV的衣殼蛋白，在體外能夠自行組裝成VLP，是RHDV新型疫苗、診斷試劑開發(fā)的重要抗原蛋白。研究者嘗試過大腸桿菌表達系統(tǒng)[18]、桿狀病毒表達系統(tǒng)[19]、轉(zhuǎn)基因植物[20-21]、腺病毒載體[22-23]、畢赤酵母表達系統(tǒng)[24-25]等多種方式表達重組VP60蛋白，這幾種生產(chǎn)重組VP60蛋白的方式中，桿狀病毒表達系統(tǒng)具有外源基因容量大、翻譯后修飾、生物安全性好、體外培養(yǎng)簡單等特點，被廣泛地應(yīng)用于不同物種來源的重組蛋白生產(chǎn)[14,26-29]。BVES表達的重組VP60蛋白，免疫機體后，能夠產(chǎn)生細(xì)胞免疫和高水平的體液免疫[30]。BVES是生產(chǎn)重組VP60蛋白的理想方式，但BVES生產(chǎn)的重組VP60蛋白產(chǎn)量相對不高，不能滿足實際生產(chǎn)的需要。

圖3 SDS-PAGE和Western blot鑒定重組RHDV VP60蛋白Fig.3 SDS-PAGE and Western blot identification of recombinant RHDV VP60 protein

表3 不同構(gòu)建方式拯救的rAc-RHDV-VP60的△log2HA效價Table 3 △log2HA titer statistics of rAc-RHDV-VP60 rescued by different construction methods

根據(jù)Hr1、Hr3增強子、CAG強啟動子能夠增強目的基因轉(zhuǎn)錄，WPRE能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控mRNA，SV40啟動子能夠在感染早期階段表達目的基因，Melt信號肽能夠引導(dǎo)目的蛋白進行分泌表達等特性，本研究選擇應(yīng)用以上元件及元件組合改造供體質(zhì)粒，在載體水平優(yōu)化以提升重組VP60蛋白在BVES中的表達量，旨在降低重組VP60蛋白生產(chǎn)成本。研究結(jié)果表明：使用Hr1、Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE、SV40-WPREMelt改造類型的供體質(zhì)粒均能夠提高重組VP60蛋白產(chǎn)量，提升效果最為顯著的是Hr3、SV40-WPRE改造類型的供體質(zhì)粒，表達的重組VP60蛋白均具有良好的反應(yīng)原性，關(guān)于表達的重組VP60蛋白免疫原性及蛋白穩(wěn)定性，有待進一步研究。

與Lop é z-Vidal等[31]將Hr1與Ac-ie-01調(diào)控元件組成的TB表達盒提升重組VP60蛋白表達量相比，本研究Hr1的提升作用與TB表達盒相當(dāng)，而Hr3、SV40、Hr1-WPRE、Hr3-WPRE、SV40-WPRE提升效果高于TB表達盒，這可能與Hr3、SV40轉(zhuǎn)錄效率高于Hr1，WPRE翻譯后調(diào)控效率高于Ac-ie-01有關(guān)，還與啟動子、增強子與WPRE翻譯后調(diào)控元件組合后，目的蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯效率疊加增強相關(guān)。與Yang等[32]報道的在豬瘟病毒E2蛋白基因前添加Melt信號肽序列能夠顯著提高E2蛋白的分泌表達相比，添加Melt對重組VP60蛋白分泌表達無提升作用。這可能與重組VP60蛋白直接組裝成VLPs以分泌蛋白形式表達，無需信號肽誘導(dǎo)有關(guān)，添加信號肽序列反而增加了蛋白后期修飾工作，影響蛋白表達產(chǎn)量。與Shang等[33]報道的在pFastBac供體質(zhì)粒中將SV40 polyA替換為Polh polyA能夠提高重組蛋白產(chǎn)量相比，本研究中將Polh啟動子替換為SV40啟動子后對重組VP60蛋白產(chǎn)量提升效果更為顯著，這可能與SV40啟動子替換Polh啟動子后，pFastBacDual中間轉(zhuǎn)移載體的SV40 polyA提高了mRNA穩(wěn)定性與翻譯效率有關(guān)。

本研究通過改造pFastBacDual供體質(zhì)粒，優(yōu)化重組VP60蛋白在Bac-to-Bac系統(tǒng)中的表達，得到的重組VP60蛋白具有表達產(chǎn)量高、反應(yīng)原性好等特點，為更低成本生產(chǎn)RHDV亞單位疫苗和診斷試劑的開發(fā)提供參考，同時對其他亞單位疫苗在BVES的優(yōu)化表達具有一定的借鑒意義。