汪 挺，譚健暉，李 鵬，唐生森，楊章旗,

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；3.廣西馬尾松工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530002)

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國南方最主要的針葉樹種，其適應(yīng)能力強，生長迅速，綜合利用程度高，在廣西作為用材與產(chǎn)脂樹種廣泛種植[1]。隨著全球氣候變暖和水資源緊缺加劇，植物面臨干旱脅迫的幾率大大增加，對抗旱材料的選育和抗旱機制的研究成為林木研究的熱點[2-3]。廣西屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年降雨量充足，但其地形復(fù)雜，以山地為主，受季風(fēng)和地形的共同影響，導(dǎo)致雨水分布不均，東部多而西部少，形成多發(fā)季節(jié)性干旱和半干旱區(qū)域災(zāi)害。干旱脅迫是影響馬尾松產(chǎn)量和造林成活率的主要因素，嚴(yán)重制約馬尾松用材林與產(chǎn)脂林的發(fā)展[4-5]，培育抗旱品種，是應(yīng)對干旱脅迫的一種經(jīng)濟有效的措施[6]。目前，關(guān)于馬尾松的抗旱性報道集中于基礎(chǔ)理論研究，利用不同種源馬尾松幼苗進行干旱脅迫篩選和抗旱適應(yīng)性機理的探討。韓文萍等[7]研究表明，干旱脅迫下不同種源馬尾松間的生理指標(biāo)變化趨勢相似，但變化幅度有較明顯差異；胡曉健[8]研究表明，不同種源馬尾松抗旱性與生長性狀和生理性狀有關(guān)。這些研究大多集中于種源水平或個體，而涉及二代家系水平下研究較少，缺乏對二代家系水平下馬尾松耐旱家系的批量篩選。此外，植物生長特性作為反映植物苗期耐旱適應(yīng)性的最直觀指標(biāo)，隨干旱水平的增加具有顯著差異，且植物生長發(fā)育特性受形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)的調(diào)控，兩者之間存在顯著相關(guān)關(guān)系[9-10]。杜明鳳等[11]研究表明，生長指標(biāo)是研究馬尾松抗旱性的首要指標(biāo)，并且其與生理指標(biāo)顯著相關(guān)。李佩佩等[12]研究顯示，植物抗旱性是可遺傳的，苗期可以作為植物抗旱性鑒定的重要時期，生長與形態(tài)均比萌發(fā)期直觀。林木抗旱性的表現(xiàn)形式是復(fù)雜的多指標(biāo)性狀，使用單一評價方法難以準(zhǔn)確描述其抗旱能力，因此，越來越多的研究者采用隸屬函數(shù)、因子分析、綜合抗逆性D值和聚類分析等綜合評價方法進行鑒定參試品種耐旱性[13-15]。

文中以馬尾松二代種子園54個優(yōu)良家系為研究對象，在防雨大棚內(nèi)持續(xù)自然干旱脅迫和反復(fù)復(fù)水干旱脅迫，進行生長和形態(tài)特征的研究，測定干旱脅迫下各家系的生長指標(biāo)，采用因子分析與隸屬函數(shù)分析評價家系間的耐旱性。對綜合耐旱度量D值進行聚類分析，將供試家系劃分成不同耐旱等級，以期篩選適宜干旱和半干旱地區(qū)生長和應(yīng)用的耐旱型優(yōu)良家系，為后期進行大田抗旱試驗提供理論基礎(chǔ)，為推廣和應(yīng)用馬尾松耐旱型優(yōu)良家系提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院苗圃防雨大棚內(nèi)進行，該區(qū)域地理坐標(biāo)為東經(jīng)108°20′32″～108°21′10″，北緯22°50′22″～22°50′40″，海拔80m,屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫21.6 ℃，年平均濕度為80%，雨季主要集中在5—9月份，旱季主要集中在10—4月份[5]。

1.2 試驗材料

試驗材料為54個馬尾松家系(編號19-201～19-255)，種子采自于廣西國有派陽山林場馬尾松二代種子園。2019年2月，在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院馬尾松良種繁育苗圃進行播種，發(fā)芽后轉(zhuǎn)移至無紡纖維布容器(直徑5 cm，高8 cm)育苗，基質(zhì)材料配比為V椰糠∶V黃心土∶V泥炭土=6∶3∶1。2019年9月，各家系選取生長一致的健康苗木30株進行試驗,家系平均苗高為(24.33±4.39) cm，平均地徑為(3.44±0.54) mm。

1.3 試驗設(shè)計

采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，設(shè)置3個隨機區(qū)組(重復(fù)3次)，每個隨機區(qū)組54個家系，每個區(qū)組內(nèi)各家系以10株為1行，按株距10 cm，行距20 cm，去掉容器后移栽至溫室大棚里的試驗地，實施干旱脅迫，外圍設(shè)置保護行，脅迫前每天正常澆水緩苗。于2019年10月開始干旱脅迫試驗，脅迫前給苗木澆透水，之后停止?jié)菜?，模擬自然干旱脅迫30 d，記錄苗木的萎蔫度，測定苗高與地徑，同時給苗木復(fù)水，每行800 mL，復(fù)水7 d后待植株恢復(fù)正常生長時，統(tǒng)計各家系苗木存活率[5]。繼續(xù)實施干旱脅迫，如此重復(fù)3次，第3次脅迫復(fù)水后，待植株恢復(fù)正常生長時統(tǒng)計各家系苗木保存率。每塊試驗地規(guī)格為12 m(長)×1.2 m(寬)×0.2 m(高)，培養(yǎng)所采用的土壤為馬尾松林下黃心土。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 存活率與保存率計算 各家系持續(xù)干旱脅迫的存活率與反復(fù)復(fù)水干旱脅迫的保存率計算公式如下：

(1)

式中：S為存活率；ni為第1次脅迫復(fù)水后第i個家系苗木的存活株數(shù)；Ni為第i個家系試驗苗木總數(shù)。

(2)

式中：P為保存率；mi為第3次脅迫復(fù)水后第i個家系苗木的存活株數(shù)；Mi為第i個家系試驗苗木總數(shù)。

1.4.2 萎蔫度計算 萎蔫度的評價與計算參照徐超等[16]方法。萎蔫級數(shù)：0級(健康)；Ⅰ級(少數(shù)針葉出現(xiàn)萎蔫)；Ⅱ級(半數(shù)針葉出現(xiàn)萎蔫)；Ⅲ級(半數(shù)以上針葉萎蔫)；Ⅳ級(整株萎蔫)。萎蔫度計算公式如下：

(3)

式中：W為萎蔫度；Φi為第i級萎蔫；Ni為第i級萎蔫株數(shù)；Φmax為最高級萎蔫；∑Ni為總株數(shù)。

1.4.3 因子分析計算 利用R軟件mvstats包的factpc函數(shù)，對干旱脅迫下各生長指標(biāo)進行因子分析，計算各主因子方差貢獻率及得分值。

(4)

式中：f(xi)為第i個綜合指標(biāo)的隸屬度函數(shù)值；Xi為第i個綜合指標(biāo)值；Xmin、Xmax為所有參試材料第i個綜合指標(biāo)的最小值、最大值。

(5)

1.4.4 聚類分析計算 利用R軟件factoextra包的fviz_dend函數(shù)，以綜合耐旱度量D值為指標(biāo)，采用Euclidean-Complete法計算距離,進行系統(tǒng)聚類分析，將54個家系聚類為不同耐旱類型。

采用Excel 2016、R 3.6.3軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松不同家系幼苗對干旱脅迫的生長響應(yīng)

對54個馬尾松家系進行持續(xù)干旱脅迫30 d，各生長指標(biāo)對干旱脅迫響應(yīng)變化如圖1(a)所示。各家系苗高增長量變幅最大，分布區(qū)間為0.6～1.8 cm；地徑增長量分布區(qū)間為0.01～0.38 mm；萎蔫度分布區(qū)間為34.48%～68.0%，主要分布在49.14%～59.17%；存活率分布區(qū)間為23.33%～96.67%，主要分布在53.33%～86.87%。各指標(biāo)變異系數(shù)如圖1(b)所示，干旱脅迫下各生長指標(biāo)的變異系數(shù)均大于10%，其中地徑增長量變異系數(shù)最大，達到96.02%，對干旱脅迫最敏感。

2.2 持續(xù)干旱脅迫下各生長指標(biāo)的相關(guān)分析

對各生長指標(biāo)進行相關(guān)性分析(表1)。結(jié)果表明：持續(xù)干旱脅迫下，地徑增長量與存活率極顯著正相關(guān)，與萎蔫度極顯著負相關(guān)；萎蔫度與存活率極顯著負相關(guān)；苗高增長量與地徑增長量相關(guān)性不顯著。各生長指標(biāo)間存在不同程度的關(guān)聯(lián)，說明耐旱是多指標(biāo)互作的過程，根據(jù)單一指標(biāo)進行評價不能準(zhǔn)確反應(yīng)家系耐旱性。

圖1 干旱脅迫下各指標(biāo)變化分布

表1 干旱脅迫下各指標(biāo)相關(guān)系數(shù)

2.3 持續(xù)干旱脅迫下各家系耐旱因子分析

為了避免各生長指標(biāo)間的相關(guān)性造成信息重疊，對持續(xù)干旱脅迫下各指標(biāo)進行因子分析，根據(jù)累積方差貢獻率大于85%的原則，選擇前3個主因子作為數(shù)據(jù)分析的有效成分，其累積方差貢獻率達到94.56%，其中載荷量的高低反映主因子與各指標(biāo)的相關(guān)程度(表2)。第1主因子與存活率和萎蔫度相關(guān)性最大，因子載荷分別是0.93和-0.90，主要反映各家系干旱脅迫下的存活情況，可稱為存活因子。第2主因子與地徑增長量相關(guān)性最大，因子載荷為0.96，主要反映各家系干旱脅迫下的苗木地徑變化，可稱為地徑因子。第3主因子與苗高增長量相關(guān)性最大，因子載荷為1.00，主要反映各家系干旱脅迫下苗高變化，可稱為苗高因子。根據(jù)回歸估計法計算因子得分，以各因子的方差貢獻率占3個因子總方差貢獻率的比重計算權(quán)重。

表2 因子載荷與方差貢獻率

2.4 馬尾松不同家系耐旱性的隸屬函數(shù)分析

在因子分析的基礎(chǔ)上，利用隸屬函數(shù)法對54個馬尾松家系耐旱性進行綜合評價，計算各主因子的隸屬值f(xi)和權(quán)重Wi，并計算代表各家系耐旱能力的綜合耐旱度量D值，D值變幅為0.090～0.748，按其大小進行排名(表3)。結(jié)果表明：19-249和19-220家系耐旱性相對較高，D值分別為0.748和0.743；19-208和19-219家系耐旱性相對較低，D值分別為0.090和0.235。

表3 馬尾松不同家系耐旱性綜合評價

續(xù)表3

2.5 馬尾松不同家系幼苗耐旱性等級劃分

采用歐式距離-最長距離法對綜合耐旱度量D值進行系統(tǒng)聚類分析(圖2)。在歐式距離為0.3的位置，可將54個馬尾松家系分為3大類耐旱等級：Ⅰ類為高度耐旱型，包括19-220、19-242和19-249等14份家系材料，D值平均值為0.644；Ⅱ類為耐旱型，包括19-201、19-224和19-252等29份家系材料，D值平均值為0.463；Ⅲ類為干旱敏感型，包括19-208、19-219和19-248等11份家系材料，D值平均值為0.275。

圖2 馬尾松不同家系耐旱性聚類分析

2.6 復(fù)水干旱脅迫下馬尾松幼苗保存率的分布特征

根據(jù)3次復(fù)水干旱脅迫試驗，將保存率作為家系耐旱性評價方法。結(jié)果表明：54個馬尾松家系保存率差異較大，變異幅度為0～66.67%；19-236和19-242家系耐旱性較好，保存率分別為66.67%和63.33%；19-207和19-208家系耐旱性較差，保存率均為0(圖3)。

圖3 復(fù)水干旱脅迫保存率

2.7 馬尾松幼苗保存率與生長特性的相關(guān)性分析

以持續(xù)干旱脅迫各生長指標(biāo)為x軸，復(fù)水干旱脅迫保存率為y軸，進行線性回歸分析(圖4)。結(jié)果表明，苗高增長量與地徑增長量對保存率擬合效果不佳，決定系數(shù)(R2)分別為0.025和0.102[圖4(a 、 b)]；萎蔫度與保存率擬合效果較好，回歸方程為y=-2.032x+1.376，其中R2=0.600，P<0.001[圖4(c)] ；持續(xù)干旱脅迫存活率與復(fù)水干旱脅迫保存率擬合效果最好，回歸方程為y=0.772x-0.237，其中R2=0.690，P<0.001[圖4(d)]，回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 保存率與生長指標(biāo)回歸分析

以綜合耐旱度量D值為x軸，復(fù)水干旱脅迫保存率為y軸，進行線性回歸分析(圖5)。結(jié)果表明：

回歸方程為y=0.946x-0.154，其中決定系數(shù)R2=0.562，P<0.001，回歸擬合效果較好，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明兩個指標(biāo)存在直線回歸關(guān)系，短期持續(xù)干旱脅迫綜合評價結(jié)果與長期復(fù)水干旱脅迫結(jié)果有較好一致性。

3 討論與結(jié)論

近年來，對馬尾松的耐旱性研究集中于生理響應(yīng)和分子調(diào)控機制，對不同家系耐旱性能力的評價與篩選有待探索。植物的抗早性評價指標(biāo)主要有形態(tài)特征、生長發(fā)育、生理生化、產(chǎn)量鑒定指標(biāo)等，由于生長指標(biāo)與這些生理生化指標(biāo)之間存在強相互關(guān)系，因此在一定程度上可以用存活率、萎蔫度、苗高和地徑等生長指標(biāo)作為大規(guī)模家系的評價與鑒定[17-19]。利用苗木生長和形態(tài)性狀進行大規(guī)模耐旱性篩選，是一種經(jīng)濟有效措施，對于馬尾松耐旱性的遺傳改良是非常必要的。

圖5 保存率與D值回歸分析

本研究中，隨著干旱脅迫程度增強，馬尾松不同家系苗木各生長指標(biāo)表現(xiàn)不同程度變異，變異系數(shù)均大于10%，其中地徑生長量變異系數(shù)達到96%，對干旱脅迫的反應(yīng)極為敏感。表明植物生長指標(biāo)作為馬尾松耐旱脅迫的敏感型指標(biāo)，其不同家系間生長情況的差異性可作為篩選馬尾松耐旱性家系的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。相關(guān)性分析表明，地徑增長量與存活率極顯著正相關(guān)，萎蔫度與存活率極顯著負相關(guān)，說明在相同干旱脅迫下馬尾松幼苗存活率較高的家系，其地徑生長量的累積較大，通過自身根系的增加和植物養(yǎng)分的蓄積具有更強的抗旱性能。

通過因子分析和隸屬函數(shù)加權(quán)計算的D值是一個無量綱的數(shù)，使各家系的特性差異具有可比性，被廣泛用于植物抗逆性評價[20]，任毅等[15]通過D值鑒定了301份小麥品種的耐旱性，崔博文等[21]利用D值評價不同馬尾松種源耐低磷性。本研究顯示，綜合評價最終獲得14個高抗旱型家系:19-203、19-215、19-220、19-232、19-233、19-236、19-238、19-242、19-243、19-247、19-249、19-251、19-254、19-255，這些高度抗旱型家系可作為今后干旱和半干旱地區(qū)種植的首先種質(zhì)，用于這些區(qū)域馬尾松耐旱型優(yōu)良家系的推廣和使用，并通過對這些優(yōu)良家系種質(zhì)資源的收集，進行大量組配，培育適宜大范圍種植和推廣的優(yōu)良基因型家系，從而實現(xiàn)目標(biāo)性狀有效聚合。對復(fù)水干旱脅迫保存率與D值進行線性回歸分析，回歸方程為y=0.946x-0.154(R2=0.562，P<0.001)，表明兩個指標(biāo)評價結(jié)果具有顯著相關(guān)性，因此，通過持續(xù)干旱脅迫下生長指標(biāo)可以綜合評價家系耐旱性強弱。在一定范圍內(nèi)可通過持續(xù)自然干旱脅迫的試驗結(jié)果代替反復(fù)復(fù)水干旱脅迫試驗，進而在一定程度減少苗木的損失。本研究通過綜合耐旱度量D值評價各家系耐旱性，利用系統(tǒng)聚類分析將54個家系耐旱性進行分等定級，篩選出3類不同耐旱型家系：高度耐旱型(14個家系)、耐旱型(29個家系)、干旱敏感型(11個家系)。在接下來的研究中，以高度耐旱型家系作為試驗材料，對其耐旱適應(yīng)性的生理生化反應(yīng)，以及分子和基因調(diào)控機制方面，有待進一步研究。