孫華樂，翟曉巧，曹喜兵，鄧敏捷，趙振利，范國強(qiáng)

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省林業(yè)科學(xué)研究院,河南 鄭州 450008)

通過基因組加倍、多倍化在物種形成及植物進(jìn)化中都起著十分重要的作用。多倍體通常表現(xiàn)出諸多優(yōu)良性狀，如生物量增加、抗逆性增強(qiáng)、對病蟲害抗性增強(qiáng)等，這些優(yōu)良性狀在植物育種中具有重要意義[1]。白花泡桐[Paulowniafortunei(Seem.) Hemsl.]為泡桐科泡桐屬植物，原產(chǎn)于中國，是重要的庭院綠化、速生用材以及防護(hù)樹種，具有重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[2]。范國強(qiáng)等[3]用二倍體白花泡桐葉片，利用秋水仙素成功誘導(dǎo)出其同源四倍體，擴(kuò)大了泡桐的種質(zhì)資源。與二倍體相比，白花泡桐四倍體具有更優(yōu)良的光合特性和更強(qiáng)的抗逆性[4-5]。然而，目前四倍體優(yōu)良性狀在蛋白質(zhì)水平的分子機(jī)制尚不清楚，有關(guān)白花泡桐二四倍體間的蛋白質(zhì)組變化仍有待探討。

文中利用同位素標(biāo)記相對定量和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術(shù)對白花泡桐二四倍體的蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量研究，分析兩者之間蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異，并對差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析篩選與四倍體形成特異蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步了解四倍體泡桐優(yōu)良特性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料來源于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所培養(yǎng)的二倍體及其同源四倍體白花泡桐，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度為130 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間為16 h·d-1。分別剪取上述兩種培養(yǎng)30 d，長約1.5 cm，長勢一致的組培苗頂芽，用液氮冷凍后迅速置于-80℃冰箱內(nèi)。樣品標(biāo)記為：二倍體白花泡桐(B2、B2_1)；四倍體白花泡桐(B4、B4_1)。每個(gè)樣品各兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 蛋白質(zhì)提取、iTRAQ標(biāo)記與預(yù)分離

使用丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，分別從B2和B4兩種樣品中提取100 μg蛋白質(zhì)并用iTRAQ試劑標(biāo)記獲得肽段，根據(jù)QIAOetal[6]使用的方法將蛋白質(zhì)消化并用iTRAQ技術(shù)標(biāo)記，將標(biāo)記后的各組肽段依次進(jìn)行混合、分離、除鹽和抽干。具體操作步驟詳見文獻(xiàn)[7]。

1.3 肽段分離與液相串聯(lián)質(zhì)譜分析

將抽干得到的組分用緩沖液A(5%乙腈，0.1%甲酸)重懸,用液相色譜儀(型號LC-20 AD，日本京都島津)和分離柱對樣品進(jìn)行分離,分離后傳輸至AB SCIEX Triple TOF 5600 質(zhì)譜系統(tǒng)(美國)，動態(tài)參數(shù)設(shè)置詳見文獻(xiàn)[8]。

1.4 蛋白質(zhì)鑒定與定量分析

使用Mascot 2.3.02軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定，數(shù)據(jù)庫來源于白花泡桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，相關(guān)測序數(shù)據(jù)已上傳到美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的序列片段歸檔數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra, SRA)，登錄號為SRP032166[9]。對鑒定到的蛋白質(zhì)在基因本體論(gene ontology，GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行功能注釋。蛋白質(zhì)的差異標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)>1.2或<0.83，且P<0.05。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證

采用植物總RNA提取試劑盒提取B2和B4中的總RNA。隨機(jī)挑選8個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，用Taq SYBRGreen qPCR Premix試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)，在美國伯樂公司的CFX96TM Real-TimeSystem熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測系統(tǒng)上完成。參照DONGetal[10]方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品3次重復(fù)。使用18 S rRNA作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用2-△△Ct法。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR分析所用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的鑒定與功能分析

為了解白花泡桐二四倍體蛋白質(zhì)組的整體信息，對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量檢測。兩個(gè)樣品蛋白質(zhì)含量符合試驗(yàn)要求(表2)。共鑒定到458 154個(gè)圖譜，Mascot搜庫后，匹配到6 757個(gè)圖譜，6 424個(gè)特有圖譜，肽段和特有肽段分別為1 229個(gè)和1 199個(gè)，最終鑒定到696個(gè)蛋白質(zhì)[(圖1(a)]，這些蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量主要集中在10～60 ku，其中占較大比例的范圍為10～20 ku[(圖1(b)]，肽段長度主要集中在7～15個(gè)氨基酸[(圖1(c)]，肽段序列覆蓋度在5%～10%的蛋白質(zhì)占比最多[(圖1(d)]。

表2 白花泡桐蛋白質(zhì)信息

注:圖1(d)中括號內(nèi)的數(shù)字代表肽段序列覆蓋在每個(gè)區(qū)間中蛋白質(zhì)的數(shù)量。Note：the numbers in brackets in figure 1 (d) represent the number of proteins in each interval covered by the peptide sequence.

2.2 差異蛋白質(zhì)分析

為進(jìn)一步了解四倍體優(yōu)良特性相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，對B2和B4兩樣本鑒定到的總蛋白質(zhì)進(jìn)行差異分析。結(jié)果共鑒定到75個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中，39個(gè)上調(diào)，36個(gè)下調(diào)。GO富集分析結(jié)果顯示，顯著性富集的GO條目有40個(gè)：細(xì)胞組分主要條目有胞漿、液泡、核糖體[圖2(a)]；生物進(jìn)程主要條目有非生物刺激響應(yīng)、前體代謝物和能量的產(chǎn)生、滲透脅迫響應(yīng)[圖2(b)]；分子功能主要條目有銅離子結(jié)合、果糖二磷酸醛縮酶活性、醛裂合酶活性[圖2(c)]。KEGG通路富集分析參與了35條代謝通路，主要包括代謝途徑(29，48.33%)、糖酵解/糖異生(7，11.67%)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(17，28.33%)、光合生物的碳固定(8，13.33%)和氧化磷酸化(5，8.33%)等(表3)。

圖2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的基因本體論功能注釋分類

表3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路分析

2.3 蛋白質(zhì)組與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析

為了篩選與倍性相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，把上述得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)與白花泡桐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示，總蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)到18 984個(gè)基因，其中75個(gè)差異蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)到1 158個(gè)基因,在75個(gè)差異蛋白質(zhì)中，有65個(gè)對應(yīng)的基因在轉(zhuǎn)錄水平上變化不明顯；有37個(gè)不差異的蛋白質(zhì)，但其對應(yīng)的基因在轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)。在關(guān)聯(lián)到的9個(gè)差異蛋白質(zhì)中，有7個(gè)蛋白質(zhì)變化趨勢與其對應(yīng)基因的變化趨勢一致，這7個(gè)蛋白質(zhì)中有4個(gè)注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，分別是鎂螯合酶H亞基(m.55631)、V型H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase亞基A(m.33869)、細(xì)胞色素C氧化酶亞基5b(m.12004)和果糖二磷酸醛縮酶(m.24953)；有兩個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)豐度變化趨勢和其對應(yīng)基因的變化趨勢相反，蛋白質(zhì)豐度減少，但其對應(yīng)的基因均上調(diào)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)只有玉米黃素環(huán)氧化酶(m.32969)注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中。

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測序結(jié)果的可靠性，在B2和B4文庫中隨機(jī)挑選m.13192(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)、m.29938(L-抗壞血酸氧化酶)、m.24953(果糖二磷酸醛縮酶)、m.40032(銅氧化酶)、m.32969(玉米黃質(zhì)環(huán)氧酶)、m.39316(蛋白二硫鍵異構(gòu)酶A1)、m.9824(2-磷酸乙醇酸磷酸酶1)、m.16063(羧亞甲基丁烯酸酶)等8個(gè)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖3)。B2表達(dá)量歸一化為1，18 S rRNA作為內(nèi)參。結(jié)果顯示：4個(gè)基因在蛋白質(zhì)水平和轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)，4個(gè)基因在蛋白質(zhì)水平上調(diào)而在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這種結(jié)果可能是由于基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾，或者mRNA和蛋白質(zhì)的降解等因素造成的。

注：**表示B2和B4之間差異達(dá)0.01顯著水平；*** 表示B2和B4之間差異達(dá)0.001顯著水平。Note： ** represents significant differences between B2 and B4(P<0.01),and *** represents significant differences between B2 and B4(P<0.001).

3 討論與結(jié)論

植物在受到生物脅迫(如植原體、病毒、真菌等)和非生物脅迫(如高低溫、干旱、鹽漬等)時(shí)啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而產(chǎn)生抗性[11]。相對于同源二倍體，多倍體植物的抗逆性更強(qiáng)，比如冷調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性[12]和光保護(hù)[13]，多倍化有助于競爭能力的進(jìn)化[14]。多倍化植物在形態(tài)和生理上有一定程度的變化，如器官增大、抗逆性增強(qiáng)等，另外，植物內(nèi)部代謝物的產(chǎn)量、營養(yǎng)成分、內(nèi)源激素以及次生代謝物質(zhì)等的變化也對抗逆性有所增強(qiáng)。文中利用iTRAQ技術(shù)對二倍體及其同源四倍體白花泡桐的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究，從蛋白質(zhì)層面上了解二四倍體植物之間生理生化指標(biāo)的差異。前人研究結(jié)果表明，泡桐同源四倍體中與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因相對于二倍體顯著上調(diào)[15-18]。此外，泡桐同源四倍體響應(yīng)干旱脅迫和鹽脅迫的microRNA對應(yīng)的靶基因與二倍體親本相比上調(diào)，增加了其對環(huán)境的適應(yīng)性[19-21]。

與二倍體親本相比，白花泡桐四倍體參與應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫的蛋白質(zhì)差異表達(dá)。例如，在泡桐發(fā)育和脅迫耐受性中起重要作用的果糖二磷酸醛縮酶(m.24953)和L-抗壞血酸氧化酶(m.29938)。結(jié)果表明，對同源四倍體蛋白質(zhì)豐度的調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致了其對環(huán)境適應(yīng)性的增強(qiáng)。因此，與二倍體親本相比，脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)和光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)在四倍體白花泡桐中的豐度均較高，為四倍體泡桐生長抗逆性強(qiáng)和生長速度快的優(yōu)良特性提供了解釋。

在植物中抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)屬于多銅氧化酶家族，定位于植物細(xì)胞壁[22]。AAO具有重要的意義，與植物生長發(fā)育、逆境和衰老等有關(guān)[23]。AAO在四倍體白花泡桐中表達(dá)量明顯高于二倍體，對同源四倍體蛋白質(zhì)豐度的調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致了其對環(huán)境適應(yīng)性的增強(qiáng)。

鎂螯合酶主要由H、I和D三個(gè)亞基組成[24-25]，通過催化原卟啉IX和Mg2+螯合形成鎂原卟啉IX，它是葉綠素合成過程中的關(guān)鍵酶。其中，鎂螯合酶H亞基為該復(fù)合體主體，在反應(yīng)中起到關(guān)鍵性作用，其它亞基,如I和D亞基可能通過H亞基參與調(diào)控[26]，其表達(dá)均能影響葉綠素合成[27]。通過這3種主要亞基的協(xié)調(diào)以及配合，并在ATP驅(qū)動下，Mg2+與原卟啉IX螯合，最后推動葉綠素合成。鎂螯合酶H亞基在四倍體泡桐中表達(dá)量明顯高于二倍體，這說明四倍體在葉綠素合成、抑制黃化等方面明顯增強(qiáng)。

從文中的蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)得出了不同的豐度/表達(dá)結(jié)果,這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)錄后調(diào)控或翻譯后修飾未將基因表達(dá)差異轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)豐度差異，或者是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)水平低估了同源四倍體與二倍體親本之間的差異，基于iTRAQ的分析，確定了差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量估計(jì)不同樣品的倍數(shù)變化。據(jù)報(bào)道，基于iTRAQ的方法可能存在準(zhǔn)確性低的問題，因?yàn)樗鼈兛赡軙到y(tǒng)地低估比率，尤其是當(dāng)比率變化較大時(shí)[28]。蛋白質(zhì)豐度和mRNA表達(dá)水平之間一致性較缺乏,主要是由以下幾個(gè)因素造成：轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后修飾可以使蛋白質(zhì)豐度和mRNA表達(dá)水平間有差異的存在,例如，調(diào)節(jié)其靶基因表達(dá)的small RNA(包括micro RNA)在許多生物學(xué)過程中(如抗病抗旱等)發(fā)揮重要作用[29];不同試驗(yàn)技術(shù)的局限性也可能導(dǎo)致此問題;由于基因表達(dá)有一定時(shí)空特異性，因此,不同生長階段、生長部位的組織可能會導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不同。對整個(gè)組織的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究可能會得出更全面的信息，而對特定細(xì)胞器的研究可能會更準(zhǔn)確地顯示差異。總之，盡管相關(guān)性不是很高，但轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的各自及關(guān)聯(lián)分析對于深刻了解多倍體至關(guān)重要。

本研究利用iTRAQ及液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對白花泡桐二倍體及其同源四倍體的蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量，尋找與四倍體形成相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因。在研究中獲得了二倍體和四倍體白花泡桐蛋白質(zhì)圖譜，鑒定到了與抗逆和光合作用等相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，預(yù)測銅氧化酶、L-抗壞血酸氧化酶、鎂螯合酶與白花泡桐多倍化相關(guān)，指出了二倍體及其同源四倍體在蛋白質(zhì)水平上的差異，為培育新的泡桐品種和擴(kuò)大現(xiàn)有種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。