劉 夢(mèng)，魏玉磊，丁 冬，趙訓(xùn)超，羅偉毅，徐晶宇

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省秸稈資源化利用工程技術(shù)研究中心,黑龍江 大慶 163319)

脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)是一種含非血紅素鐵的脂肪酸雙加氧酶，廣泛分布于動(dòng)物和植物中[1]。在植物中，LOX的基本底物是亞麻酸和亞油酸，根據(jù)在底物上的加氧位置，LOX大致可分為2個(gè)亞家族9-LOX和13-LOX[2]。研究表明，LOX是多功能酶，9-LOX亞家族基因在種子發(fā)育[3]、器官發(fā)育[4]、果實(shí)發(fā)育[5-6]中具有重要作用。13-LOX亞家族基因在植物發(fā)育及響應(yīng)逆境脅迫(如病原侵染、蟲(chóng)害、鹽和干旱脅迫等)中具有重要作用[7-9]。目前，已經(jīng)在多種植物中進(jìn)行了LOX基因家族全基因組鑒定，其中，大豆中有19個(gè)[10]，水稻、馬鈴薯和西紅柿中均有14個(gè)[11-12]，苜蓿中有15個(gè)[12]，葡萄中有18個(gè)[12]，玉米中有13個(gè)[13]，擬南芥中則被鑒定出有6個(gè)LOX 基因，其中AtLOX2、AtLOX4和AtLOX6屬于13-LOX亞族，AtLOX1和AtLOX5屬于9-LOX亞族[14]。

高粱(SorghumbicolorL.)是非常重要的經(jīng)濟(jì)作物[15]，為禾本科高粱屬一年生草本植物，是典型的喜溫作物，對(duì)低溫脅迫較敏感，尤其在萌發(fā)期和苗期[16]。目前，高粱中關(guān)于LOX全基因組鑒定及其應(yīng)答低溫脅迫的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，對(duì)高粱LOX家族基因進(jìn)行全基因組鑒定，并對(duì)其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、不同組織及低溫脅迫下的表達(dá)模式等進(jìn)行分析，以期為高粱LOX基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 高粱LOX家族基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

將擬南芥中6個(gè)LOX蛋白序列作為種子序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，獲得同一性>90%且E值<10-10的所有高粱LOX家族成員的蛋白質(zhì)序列。從http://pfam.xfam.org/網(wǎng)站上下載LOX結(jié)構(gòu)域的HMM模型(PF01477和PF00305)，利用HMMER 3.0軟件進(jìn)一步對(duì)篩選出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行LOX結(jié)構(gòu)域的查詢(xún),刪除冗余序列，確認(rèn)高粱LOX基因家族成員。

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取LOX基因的編碼區(qū)序列(CDS)和編碼蛋白質(zhì)序列等信息，查詢(xún)?nèi)旧w位置并利用Mapinspect繪制染色體定位圖譜。在SIB生物信息學(xué)資源網(wǎng)站(http://expasy.org/)上確定分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。使用WOLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)和(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.2 高粱LOX家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MAGE 7.0用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)對(duì)擬南芥、大豆和高粱LOX蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，抽樣次數(shù)(Bootstrap)設(shè)置為1 000次。

1.3 高粱LOX家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序(Motif)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用網(wǎng)站GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)預(yù)測(cè)高粱LOX基因結(jié)構(gòu)；利用網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/)預(yù)測(cè)高粱LOX基因保守基序；利用網(wǎng)站NPSA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html)預(yù)測(cè)高粱LOX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 高粱LOX家族基因表達(dá)模式分析

高粱不同組織中LOX轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/)，基因相對(duì)表達(dá)水平用FPKM值表示，利用Heml軟件繪制熱圖。

1.5 低溫處理高粱幼苗轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

選擇高粱自交系冷敏感型材料黃殼子(S)及耐冷型材料平頂香(R)進(jìn)行土培，待高粱生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)，將其放置于4 ℃低溫培養(yǎng)箱中，分別于0、12、24、72 h進(jìn)行取樣，用于LOX基因表達(dá)量分析，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法獲得基因相對(duì)表達(dá)量，基因相對(duì)表達(dá)量變化倍數(shù)用FC表示，基因相對(duì)表達(dá)量變化情況用Log2FC表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱LOX家族基因的鑒定、理化性質(zhì)及染色體定位分析

經(jīng)比對(duì)共鑒定出11個(gè)高粱LOX基因，根據(jù)其染色體位置命名為SbLOX1—SbLOX11。LOX基因CDS長(zhǎng)度介于1 638(SbLOX10)～2 775 bp(SbLOX4、SbLOX8)；編碼545(SbLOX10蛋白)～924(SbLOX4、SbLOX8蛋白)個(gè)氨基酸；編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在61.61～103.71 ku；等電點(diǎn)平均值為6.98，其中，SbLOX1、SbLOX4、SbLOX10、SbLOX11等電點(diǎn)大于7.0，呈堿性，其余7個(gè)高粱LOX蛋白等電點(diǎn)小于7.0，呈酸性(表1)。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，6個(gè)LOX蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，分別為SbLOX1、SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6、SbLOX11；5個(gè)LOX蛋白定位于葉綠體，分別為SbLOX4、SbLOX7—SbLOX10(表1)。

表1 高粱LOX基因理化性質(zhì)分析Tab.1 Physicochemical properties of LOX genes in sorghum

由圖1可知，11個(gè)高粱LOX基因不均等分布于6條染色體上(1、3、4、6、7、8)。1號(hào)染色體上有4個(gè)，(SbLOX1—SbLOX4)，3號(hào)染色體上有2個(gè)(SbLOX5和SbLOX6)， 4號(hào)染色體上有1個(gè)(SbLOX7)，6號(hào)染色體上有1個(gè)(SbLOX8)，7號(hào)染色體上有1個(gè)(SbLOX9)，8號(hào)染色體上有2個(gè)(SbLOX10和SbLOX11)。

圖1 高粱LOX家族基因在染色體上的分布Fig.1 Chromosomal distribution of LOX family genes in sorghum

2.2 高粱LOX基因家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖2可知，擬南芥、大豆、高粱LOX蛋白分為9-LOX和13-LOX兩組，9-LOX亞族包括SbLOX1、SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6、SbLOX10、SbLOX11蛋白，其中SbLOX1、SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6與擬南芥AtLOX1、AtLOX5及大豆Gm10G153900.1、Gm03G237300.1具有較高同源性，SbLOX10、SbLOX11與大豆Gm03G091000.1有較高同源性；13-LOX亞族包括SbLOX4、SbLOX7、SbLOX8、SbLOX9蛋白，其中SbLOX7、SbLOX9與擬南芥AtLOX2及大豆Gm12G054700.1、Gm13G075900.1、Gm20G053700.1具有較高同源性， SbLOX4、SbLOX8與擬南芥AtLOX3、AtLOX4及大豆Gm07G039900.1、Gm19G263300.1同源性較高。

圖2 擬南芥、大豆和高粱LOX蛋白進(jìn)化關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationships of LOX proteins from Arabidopsis,soybean and sorghum

2.3 高粱LOX家族基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

由圖3可知，高粱LOX家族基因的外顯子數(shù)目在4～9個(gè)，其中，SbLOX7基因外顯子最少。9-LOX亞族中基因結(jié)構(gòu)相似，外顯子數(shù)目為6～9個(gè)，基因長(zhǎng)度集中在6 kb以?xún)?nèi)；而13-LOX亞族中基因結(jié)構(gòu)相差較大，外顯子數(shù)目差異較大，在4(SbLOX7) ～9 個(gè)(SbLOX4)，基因長(zhǎng)度也長(zhǎng)短不一，SbLOX7最短，為4 kb，SbLOX9最長(zhǎng)，為17 kb。

圖3 高粱LOX家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.3 LOX family genes structure in sorghum

由圖4可知，在11個(gè)高粱LOX蛋白氨基酸序列中鑒定出10個(gè)保守基序。SbLOX10蛋白含有保守基序1、4、6、7、9、10；其余10個(gè)高粱LOX蛋白均含有保守基序1—10，且它們的排列順序基本相同，表明高粱LOX家族蛋白的保守基序具有很高的保守性。

圖4 高粱LOX蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of LOX protein in sorghum

2.4 高粱LOX家族蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)高粱LOX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(表2)發(fā)現(xiàn)，α-螺旋占28.99%～40.80%，無(wú)規(guī)則卷曲占35.11%～41.99%，延長(zhǎng)鏈占13.85%～23.85%，β-折疊占7.14%～11.20%，可見(jiàn)高粱LOX蛋白以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主。由圖5可知，高粱9-LOX亞家族中SbLOX1、SbLOX2蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，SbLOX3、SbLOX5、SbLOX6蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)相似；13-LOX亞家族中SbLOX4和SbLOX8蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)相似。

表2 高粱LOX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)目和比例Tab.2 Amino acid number and percentage of secondary structure of LOX proteins in sorghum

圖5 高粱LOX蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)的預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of secondary structure(A)and tertiary structure(B)of LOX protein in sorghum

2.5 高粱LOX家族基因的表達(dá)分析

2.5.1 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織中的表達(dá) 由圖6可知，9-LOX亞族中SbLOX10與13-LOX亞族中SbLOX9在高粱不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織中的表達(dá)量均較低；9-LOX亞族中SbLOX2、SbLOX3、SbLOX5與13-LOX亞族中SbLOX4、SbLOX8在高粱不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期組織中的表達(dá)量均較高，9-LOX亞族中SbLOX5除幼苗期葉片及成熟期種子外在其他時(shí)期表達(dá)量均較高。總體上，9-LOX亞族基因在高粱各組織中的表達(dá)量均高于13-LOX亞族基因。

1：幼嫩期正生長(zhǎng)的葉片；2：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期下方卷葉；3：幼嫩期下方葉片;4：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期中部卷葉;5：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期上方卷葉;6：幼嫩期上方葉片;7：開(kāi)花期下方處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉片；8：花蕾形成期下方處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉片；9：成熟期下方處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉片；10：開(kāi)花期處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉鞘; 11：花蕾形成期處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉鞘;12：成熟期處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉鞘； 13：開(kāi)花期上方處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉片；14：花蕾形成期上方處于生長(zhǎng)狀態(tài)的葉片；15：幼嫩期底層根系；16：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期底層根系；17：幼嫩期表層根系； 18：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期表層根系； 19：開(kāi)花期底層根系； 20：花蕾形成期底層根系；21：成熟期底層根系；22：花蕾形成期中層根系； 23：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期1 cm 的莖； 24：幼嫩期2 mm 的莖； 25：開(kāi)花期莖中部節(jié)間；26：成熟期莖中部節(jié)間；27：花蕾形成期上方處于生長(zhǎng)狀態(tài)的節(jié)間； 28：花蕾形成期處于生長(zhǎng)狀態(tài)的節(jié)間；29：花蕾形成期成熟節(jié)間； 30：開(kāi)花期下方圓錐花序；31：開(kāi)花期上方圓錐花序；32：花蕾形成期圓錐花序；33：花蕾形成期花梗；34：成熟期干種子；35：成熟期濕種子1：Growing leaves at immature stage；2：Below rolled leaves at vegetative stage；3：Below leaves at immature stage;4：Central rolled leaves at vegetative stage;5：Upper rolled leaves at vegetative stage; 6：Upper leaves at immature stage;7：Below growing leaves at flowering stage；8：Below growing leaves at floral initiation stage；9：Below growing leaves at mature stage；10： Growing leaf sheath at flouring stage; 11：Growing leaf sheath at floral initiation stage;12：成Growing leaf sheath at mature stage； 13：Upper growing leaves at flowering stage；14：Upper growing leaves at floral initiation stage；15：Bottom root at immature stage；16：Bottom root at vegetative stage；17：Surface root at immature stage； 18：Surface root at vegetative stage； 19：Bottom root at flowering stage；20：Bottom root at floral initiation stage；21：Bottom root at mature stage22：Middle root at floral initiation stage；23：1 cm stem at vegetative stage；24：2 mm stem at immature stage 25：Middle internode of stem at flowering stage；26：Middle internode of stem at grain maturity stage；27：Upper growing internode at floral initiation stage； 28：Growing leaf sheath at floral initiation stage；29：Mature internode at floral initiation stage； 30：Below panicle at flowering stage；31：Upper panicle at flowering stage；32：Panicle at floral initiation stage；33：Peduncle at floral initiation stage；34：Dry seed at mature stage；35：Wet seed at maturity stage

2.5.2 低溫脅迫下的表達(dá) 由圖7可看出，當(dāng)高粱幼苗低溫處理12 h時(shí)，耐冷型高粱9-LOX亞族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亞族中的SbLOX4、SbLOX7上調(diào)表達(dá)；當(dāng)高粱幼苗低溫處理24 h時(shí)，耐冷型高粱9-LOX亞族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亞族中的SbLOX4、SbLOX9依然上調(diào)表達(dá)；當(dāng)高粱幼苗低溫處理72 h時(shí)，耐冷型高粱中僅有13-LOX中SbLOX4和SbLOX9上調(diào)表達(dá)，且13-LOX中的SbLOX9在敏感型高粱中也上調(diào)表達(dá)。綜上，SbLOX1、SbLOX3、SbLOX4、SbLOX5、SbLOX9基因可能在低溫響應(yīng)中具有重要作用。

圖7 高粱LOX家族基因在低溫下的表達(dá)分析Fig.7 Expression of LOX family genes in sorghum under cold stress

3 結(jié)論與討論

1932 年LOX基因首次在大豆中被報(bào)道[17]，之后在多種植物及動(dòng)物、藻類(lèi)、真菌中都被發(fā)現(xiàn)[1]。研究表明，LOX基因在植物整個(gè)生長(zhǎng)周期都有不同程度的表達(dá)，包括種子萌發(fā)、果實(shí)成熟以及衰老等過(guò)程[18-19]，本研究對(duì)高粱中11個(gè)LOX基因在高粱不同生長(zhǎng)時(shí)期各個(gè)組織部位的表達(dá)量分析中也得到印證，9-LOX亞家族和13-LOX亞家族中的各個(gè)基因在高粱植株不同時(shí)期組織部位中均有不同程度的表達(dá)。

膜脂過(guò)氧化被認(rèn)為是一個(gè)對(duì)植物有害的過(guò)程[20]，但通過(guò)植物L(fēng)OX代謝途徑產(chǎn)生的許多代謝產(chǎn)物在抵御逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[21]，如LOX催化合成重要的信號(hào)分子茉莉酸甲酯和氧化脂質(zhì)，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中響應(yīng)各種非生物脅迫和生物脅迫[22-23]。北方地區(qū)作物早春易受低溫影響導(dǎo)致減產(chǎn)，高粱在北方地區(qū)被廣泛種植，LOX基因響應(yīng)低溫脅迫的研究已有報(bào)道，當(dāng)番茄植株低溫(4 ℃)處理時(shí)，9-LOX亞族基因成員SlLOX5和SlLOX14以及13-LOX 亞族中SlLOX4在24 h內(nèi)保持較高表達(dá)水平[24]。本研究在高粱中鑒定了11個(gè)LOX基因，當(dāng)高粱幼苗低溫處理12 h和24 h時(shí)，耐冷型高粱9-LOX亞族中的SbLOX1、SbLOX3、SbLOX5和13-LOX亞族中的SbLOX4、SbLOX9均呈上調(diào)表達(dá)；當(dāng)高粱幼苗低溫處理72 h時(shí)，耐冷型高粱13-LOX亞族中的SbLOX4和SbLOX9依然上調(diào)表達(dá)，結(jié)果與前人研究相符，LOX基因響應(yīng)低溫脅迫。

本研究利用生物信息學(xué)的技術(shù)和手段共鑒定出11個(gè)高粱LOX家族基因，分為9-LOX與13-LOX 2個(gè)亞家族。高粱LOX家族基因結(jié)構(gòu)保守，不同亞家族保守基序不存在差異性。高粱LOX基因在根、莖、葉、花序、種子中均有不同水平的表達(dá)，且一些成員對(duì)低溫脅迫有明顯的響應(yīng)，推測(cè)該家族基因在高粱不同發(fā)育階段和適應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮著重要作用。