李 強(qiáng)， 黃其田， 趙宗保

（1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部， 遼寧 大連 116023； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049）

0 引言

日益嚴(yán)峻的能源危機(jī)和能源安全形勢(shì)， 促使國(guó)家大力發(fā)展可再生能源。 生物柴油是最重要的液體可再生能源之一， 不僅在能源性質(zhì)方面可取代化石柴油，還具有安全環(huán)保等優(yōu)良特性[1]。 常規(guī)的生物柴油生產(chǎn)原料有植物油脂、 動(dòng)物油脂和餐飲業(yè)廢油等， 然而以它們?yōu)樵蠒?huì)產(chǎn)生“與人爭(zhēng)糧，與人爭(zhēng)地”的問(wèn)題，致使生物柴油的發(fā)展受到限制。微生物油脂具有和動(dòng)植物油脂相似的組成，而且微生物油脂的生產(chǎn)周期短且不受氣候和環(huán)境的限制，因此，微生物油脂是生產(chǎn)生物柴油的潛在原料[2]。

傳統(tǒng)的微生物油脂生產(chǎn)過(guò)程包括微生物油脂發(fā)酵、菌體收集、菌體干燥和胞內(nèi)油脂提取。 常用的油脂提取方法為酸熱法， 該方法以干菌體為原料，利用酸對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，具有細(xì)胞破碎充分、油脂提取徹底的優(yōu)點(diǎn)， 被認(rèn)為是最有效的油脂提取方法[3]。 但是，酸熱法以干菌體為原料，干燥步驟使得該方法工藝繁瑣且能耗巨大， 增加了油脂提取成本，限制了該方法的推廣[4]。 進(jìn)一步簡(jiǎn)化微生物油脂生產(chǎn)工藝、降低油脂提取能耗，是推廣微生物油脂的必要條件。

近年來(lái)，為了簡(jiǎn)化微生物油脂提取工藝，降低油脂提取能耗， 有研究者提出了采用濕菌泥直接進(jìn)行油脂提取的方法，并受到廣泛關(guān)注[4]。 為了從濕菌體中有效地提取油脂， 采取合理有效的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎是關(guān)鍵。 常用的細(xì)胞破壁方法主要包括物理法、生物法和化學(xué)法。物理法主要包括微波輔助法、超聲波輔助法和玻璃珠破碎法，其中，微波輔助法是通過(guò)微波加熱使細(xì)胞壁出現(xiàn)破碎，以便于油脂萃取，但該方法的能耗極高；超聲波輔助法是通過(guò)超聲波加速細(xì)胞壁破碎， 但該方法不易放大，且能耗高；玻璃珠破碎法是通過(guò)玻璃珠撞擊來(lái)破碎細(xì)胞，能耗雖低，但不易于放大且油脂提取率通常低于40%，因此不能得到廣泛應(yīng)用[5]～[7]。生物法主要是通過(guò)細(xì)胞裂解酶裂解細(xì)胞， 也有通過(guò)溶藻菌對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，反應(yīng)條件溫和，且易于放大，但裂解酶具有高度的底物選擇性，而且價(jià)格昂貴，不利于生產(chǎn)成本的控制[8]，[9]。 化學(xué)法主要包括酸熱法。 陳宏選考察了濃硫酸輔助提取微生物油脂的方法，并建立了動(dòng)力學(xué)模型[10]。

產(chǎn)油酵母是生產(chǎn)微生物油脂的優(yōu)良候選菌株，特別是圓紅冬孢酵母，它可以利用玉米秸稈水解液積累超過(guò)細(xì)胞干重60%的油脂[11]。 本文選用圓紅冬孢酵母作為生產(chǎn)微生物油脂的模式菌株，期望建立以濕菌體為原料， 以堿熱法輔助細(xì)胞破壁的提取微生物油脂的有效方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

圓紅冬孢酵母 （Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1389）購(gòu)于中國(guó)通用微生物培養(yǎng)物保藏中心（CGMCC）。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂10 g/L，pH 值為6.0。

YEPD 固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、瓊脂10 g/L、瓊脂粉15 g/L，pH值為6.0。

批式油脂發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L，酵母粉0.5 g/L，（NH4）2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子液的制備

將新鮮斜面活化好的圓紅冬孢酵母接種于裝有50 mL YEPD 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，并置于30 ℃，200 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h。

1.3.2 圓紅冬孢酵母批式油脂發(fā)酵

在3 L 的發(fā)酵罐中進(jìn)行圓紅冬孢酵母批式油脂發(fā)酵，初始裝液量為2 L，接種量為10%，溫度為30 ℃，pH 值為5.6，通氣比（每分鐘通氣量與罐體實(shí)際料液體積的比值）為0.8，溶氧為40%～50%[2]，[3]。 在批式發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)流加1 mol/L 的NaOH和1 mol/L 的HCl 自動(dòng)控制發(fā)酵液的pH 值。

1.4 油脂提取方法

1.4.1 酸熱法

每克干菌體加入4 mol/L 的HCl 6 mL，于78℃消化1 h；取出冷卻，加入等體積的氯仿和甲醇，充分混合萃取1 h；取氯仿層，向剩余物中加入等體積氯仿再萃取一次，取氯仿層；合并氯仿層，用等體積0.1%的NaCl 溶液洗滌； 取氯仿層用無(wú)水硫酸鈉干燥，并用氯仿洗滌3 次；真空蒸發(fā)除去氯仿，剩余油烘干稱(chēng)重。

在本研究中分析油脂提取率時(shí)，假定此方法的油脂提取率為100%。

1.4.2 堿熱法

圓紅冬孢酵母油脂發(fā)酵完成后，離心收集濕菌體 （含水量為90.9%）； 按比例添加不同量的NaOH（如比例為0.15，即每克干菌體添加0.15 g的NaOH）， 于不同溫度水浴中處理不同時(shí)間，用HCl 調(diào)pH 至中性； 用等體積的有機(jī)試劑萃取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，獲得油脂，烘干稱(chēng)重。

1.5 分析方法

1.5.1 脂肪酸組成分析

微生物油脂甲酯化： 稱(chēng)取70.0 mg 的待測(cè)油脂，加入5%的KOH/CH3OH 溶液0.5 mL，加熱回流50 min；然后加入BF3的甲醇溶液（BF3乙醚溶液和CH3OH 的體積比為4∶10）0.7 mL， 繼續(xù)回流10 min；冷卻后加入1 mL 去離子水和0.7 mL 正己烷，混勻后吸出有機(jī)相，經(jīng)去離子水洗滌兩遍后用于氣相色譜分析。

氣相色譜條件：FFAP 石英毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），進(jìn)樣器溫度為250 ℃，進(jìn)樣量為0.5 μL；N2流速為41 mL/min，檢測(cè)器（FID）溫度為280 ℃；H2和空氣流速分別為33，100 mL/min；柱溫為190 ℃；分流進(jìn)樣。脂肪酸甲酯通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品定性，采用面積歸一法確定相對(duì)含量。

1.5.2 中性脂組成分析

在高效薄層色譜分析儀（HPTLC，DESAGA，德國(guó)）上進(jìn)行中性脂組成分析。油脂樣品在硅膠板上點(diǎn)樣完畢后，用展開(kāi)劑（正己烷、無(wú)水乙醚和冰乙酸的體積比為80∶40∶1）展開(kāi)至前沿硅膠板3 cm處， 之后用吹風(fēng)機(jī)吹干硅膠板， 將染色液（H3PO4和CuSO4·5H2O 的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)分別為8%和10%）均勻噴灑在硅膠板上，然后于160 ℃加熱4 min 后取出，用540 nm 處可見(jiàn)光進(jìn)行掃描。

1.5.3 環(huán)境掃描電鏡分析

將堿熱處理（NaOH 的添加比例為0.15，于78℃處理3 h）后的樣品和未經(jīng)處理的樣品分別稀釋200 倍 （OD600=0.68）， 用環(huán)境掃描電鏡（Quanta650FEG，賽默飛世爾，美國(guó)）進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿熱法輔助提取油脂單因素優(yōu)化

圓紅冬孢酵母生產(chǎn)的油脂是胞內(nèi)產(chǎn)物， 被細(xì)胞壁和細(xì)胞膜所包裹， 須破壁后用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取。 傳統(tǒng)的油脂提取過(guò)程包括發(fā)酵液收集、沉降、干燥、破壁和萃取。 本研究直接以濕菌泥為原料， 用NaOH 熱輔助破壁， 再用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。為獲得更高的油脂提取率，須考察NaOH 添加比例、處理時(shí)間和溫度對(duì)油脂提取率的影響。

2.1.1NaOH 添加比例對(duì)油脂提取率的影響

圓紅冬孢酵母發(fā)酵完畢后， 首先在濕菌體中加入一定比例的NaOH，然后78 ℃水浴處理1 h，再用等體積的氯仿和甲醇萃取兩次， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑， 獲得油脂。 在每克干菌體中分別添加0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1.0 g 的NaOH 時(shí)， 即NaOH的添加比例分別為0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1 時(shí)，圓紅冬孢酵母油脂提取率的變化如圖1 所示。從圖1可以看出： 當(dāng)NaOH 的添加比例分別為0.2，0.4，0.6 時(shí)， 油脂提取率分別為24.3%，41.7%，47.0%；繼續(xù)增大NaOH 的添加比例至1.0 時(shí)， 油脂提取率仍為47.0%。 這說(shuō)明在不改變其他油脂提取條件的情況下，當(dāng)NaOH 的添加比例為0.6 時(shí)，細(xì)胞破壁比較充分，油脂提取率相對(duì)較高。

圖1 NaOH 的添加比例對(duì)油脂提取率的影響Fig.1 Effect of addition ratio of NaOH on lipid extraction yields

2.1.2 堿熱處理時(shí)間對(duì)油脂提取率的影響

當(dāng)NaOH 的添加比例為0.15， 堿熱處理時(shí)間分別為1，2，3，4，5，6 h 時(shí)， 圓紅冬孢酵母油脂提取率的變化情況如圖2 所示。從圖2 可以看出：隨著堿熱處理時(shí)間的增加，油脂提取率逐漸增加，即細(xì)胞壁裂解程度逐漸增加；當(dāng)堿熱處理時(shí)間由1 h增加到2 h 時(shí)， 油脂提取率從37.9%增加到了70.7%；當(dāng)堿熱處理時(shí)間增加到3 h 時(shí)，油脂提取率升高至84.1%；之后繼續(xù)增加堿熱處理時(shí)間，油脂提取率增加緩慢， 當(dāng)堿熱處理時(shí)間增加到5 h時(shí)，油脂提取率為90.9%。

圖2 堿熱處理時(shí)間對(duì)油脂提取率的影響Fig.2 Effect of alkali-heat treatment time on lipid extraction yields

2.1.3 堿熱處理溫度對(duì)油脂提取率的影響

堿熱處理溫度同樣影響堿熱處理效果， 溫度過(guò)低，無(wú)法到達(dá)破壁效果，溫度過(guò)高，容易使堿進(jìn)入細(xì)胞與甘油三酯發(fā)生皂化反應(yīng)， 從而降低油脂提取率。 因此， 我們考察了當(dāng)NaOH 添加比例為0.15，堿熱處理時(shí)間為3 h 時(shí)，堿熱處理溫度對(duì)油脂提取率的影響（圖3）。 從圖3 可以看出：當(dāng)堿熱處理溫度為68 ℃時(shí)， 油脂提取率僅為11.1%，這說(shuō)明在此溫度下，NaOH 對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度較低；當(dāng)堿熱處理溫度從78 ℃升高到88 ℃時(shí)，油脂提取率由87.1%下降到了62.1%。 這可能是由于部分細(xì)胞完全裂解， 油脂從細(xì)胞中釋放出來(lái)，與NaOH 發(fā)生了皂化反應(yīng)。

圖3 堿熱處理溫度對(duì)油脂提取率的影響Fig.3 Effect of alkali-heat treatment temperature on lipid extraction yields

2.2 油脂提取溶劑及條件的優(yōu)化

根據(jù)相似相容原理， 最佳的萃取溶劑既要有強(qiáng)大的油脂萃取能力，又要有較好的極性。 因此，我們考察了萃取溶劑以及萃取時(shí)間和溫度對(duì)油脂提取率的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 萃取條件對(duì)油脂提取率的影響Fig.4 Effect of extraction conditions on lipid extraction yields

從圖4 可以看出， 萃取溶劑的選擇對(duì)油脂提取率的影響很大， 而萃取時(shí)間和溫度對(duì)油脂提取率的影響很小。與前期酶處理的結(jié)果類(lèi)似，正己烷和石油醚的油脂提取率均較低，低于50%[12]。從圖4（b）可以看出：當(dāng)萃取時(shí)間不小于1 h 時(shí)，油脂提取率不再隨著萃取時(shí)間的增加而增加； 當(dāng)萃取溫度升高至40 ℃，油脂提取率也不再隨著萃取時(shí)間的增加而增加。根據(jù)相似相容的原理，萃取溶劑的疏水性越強(qiáng)，對(duì)中性脂的溶解能力就越強(qiáng)，萃取的油脂量就越大。 堿熱法提取油脂是在高水分體系中進(jìn)行的， 大量的水在細(xì)胞周?chē)纬闪艘粚訕O性“膜”，嚴(yán)重阻礙了疏水性溶劑向細(xì)胞內(nèi)的滲透，因此，選擇合適極性的油脂有利于提高油脂提取率。乙酸乙酯、 二氯甲烷和氯仿的相對(duì)極性分別為0.259，0.309 和0.228， 對(duì)油脂的萃取率分 別為88.2%，81.0%和85.5%，即乙酸乙酯的油脂提取率最高。 此外，乙酸乙酯具有毒性小、可生物降解和對(duì)環(huán)境更加友好等特點(diǎn)， 是一種較為理想的油脂萃取溶劑。

2.3 單因素優(yōu)化堿熱輔助提取油脂條件

進(jìn)行單因素優(yōu)化后， 將堿熱處理時(shí)間延長(zhǎng)至3 h，選擇處理溫度為78 ℃，選擇更加環(huán)保的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，此時(shí)，NaOH 的添加比例對(duì)油脂提取率的影響如圖5 所示。 從圖5 可以看出，當(dāng)NaOH 的添加比例為0.2 時(shí)， 油脂提取率為99.3%，比之前的24.3%（圖1）提高了3 倍。

圖5 NaOH 的添加比例對(duì)油脂提取率的影響Fig.5 Effect of addition ratio of NaOH on lipid extraction yields

2.4 堿熱處理對(duì)圓紅冬孢酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

為了更詳細(xì)地了解堿熱法用于微生物油脂回收的原理， 使用環(huán)境掃描電鏡觀察了堿熱法處理前后圓紅冬孢酵母細(xì)胞形態(tài)的變化（圖6）。從圖6可以看出：不經(jīng)任何處理時(shí)，圓紅冬孢酵母細(xì)胞呈橢球形， 細(xì)胞表面光滑且緊密； 使用堿熱法處理后，細(xì)胞壁變得粗糙且生有倒刺，但細(xì)胞并沒(méi)有塌陷或者裂解。這說(shuō)明堿熱處理雖然沒(méi)有裂解細(xì)胞，但是使細(xì)胞表面變得粗糙， 部分細(xì)胞壁多糖發(fā)生斷裂，細(xì)胞壁出現(xiàn)空洞，促進(jìn)了乙酸乙酯進(jìn)入細(xì)胞與油脂結(jié)合， 從而提高了油脂提取率。 堿熱處理后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)保持完整，沒(méi)有明顯的細(xì)胞碎片，表明堿熱處理并不會(huì)裂解細(xì)胞， 只是會(huì)對(duì)細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響， 胞內(nèi)油脂在堿熱處理過(guò)程中并未釋放出來(lái)， 可推測(cè)堿熱處理對(duì)油脂組成的影響較小。

2.5 油脂組成分析

油脂提取方法（油脂提取條件均為加入等體積的乙酸乙酯，于30 ℃萃取30 min）對(duì)油脂中性脂組成的影響如表1 所示。

由表1 可知， 通過(guò)堿熱法和酸熱法所提取得到的油脂中均具有游離脂肪酸（FFA）、單?；视?（MAG）、 二?；视?（DAG） 和甘油三酸酯（TAG）。 圓紅冬孢酵母油脂的主要成分是TAG，相對(duì)含量大于70%， 其中酸熱法獲得的油脂中TAG 的相對(duì)含量較堿熱法略高；酸熱法和堿熱法提取得到的FFA 和MAG 的相對(duì)含量相差較?。粔A熱法得到的油脂中DAG 的相對(duì)含量為24.5%，略高于酸熱法的15.9%?？傊?，堿熱法處理得到油脂的中性脂組成和含量與酸熱法相對(duì)一致。

油脂提取方法對(duì)油脂脂肪酸組成的影響如圖7 所示。從圖7 可以看出，堿熱法和酸熱法獲得油脂的脂肪酸主要由肉豆蔻酸 （C14:0）、 棕櫚酸（C16:0）、棕櫚油酸（C16:1）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亞油酸（C18:2）組成，這與文獻(xiàn)[13]的結(jié)論相一致。 兩種方法得到油脂的脂肪酸組成相同，表明堿熱法得到的油脂可用于生物柴油生產(chǎn)。

圖7 油脂提取方法對(duì)油脂脂肪酸組成的影響Fig.7 Effect of lipid extraction methods on composition of fatty acid

3 結(jié)論

本文建立了以堿熱法輔助破壁， 直接利用濕菌泥進(jìn)行微生物油脂提取的方法， 并通過(guò)單因素條件優(yōu)化， 獲得了最佳的堿熱法油脂萃取條件為濕菌泥中NaOH 的添加量為0.2 g/g，之后經(jīng)78 ℃水浴處理3 h 并用乙酸乙酯萃取， 油脂提取率可達(dá)99.3%。通過(guò)環(huán)境掃描電鏡分析可知，堿熱處理使細(xì)胞壁產(chǎn)生較多孔洞，但細(xì)胞壁并未完全裂解，油脂并未釋放到處理液中。 這些孔洞將提高有機(jī)溶劑對(duì)油脂的萃取效率， 同時(shí)又有利于保護(hù)油脂的原始組成。 由GC 和HPTLC 分析可知，堿熱法提取得到的油脂，與酸熱法無(wú)顯著差異。 因此，堿熱法是一種以濕菌體為原料直接進(jìn)行油脂提取的新方法，該方法省卻了菌體干燥的步驟，不僅可以簡(jiǎn)化微生物油脂提取工藝， 還可以降低微生物油脂提取的能耗， 為微生物油脂技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。