盧麗娜 陳浩 彭學勤 袁露 林昌洋 楊輝 魏國微 楊冬花△

(1.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科；2.貴陽中醫(yī)學院2017級研究生；3.貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽 550002)

心力衰竭時腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin angiotensin system ,RAS)激活，在心肌重構(gòu)及心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。近年發(fā)現(xiàn)的RSA新成員ACE2，可直接將AngⅡ轉(zhuǎn)化生成Ang(1-7)，而Ang(1-7)具有抑制心肌重構(gòu)的生物學功能[1]，因此，調(diào)節(jié)ACE2、AngⅡ、Ang(1-7)合成，已成為抑制心肌重構(gòu)的作用靶點。在心衰的治療中，中醫(yī)藥與西藥具有協(xié)同作用，益氣溫陽、活血化瘀、利水為主要治療方法[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣溫陽活血方從多途徑、多靶點抑制心肌重構(gòu)[3]，益母草堿是益氣溫陽活血方的主要有效成分，前期研究進一步發(fā)現(xiàn)高劑量益母草堿(30 mg/kg/d)可減少慢性心力衰竭大鼠血清心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、AngⅡ含量，抑制心肌重構(gòu)[4]，但益母草堿是否可以通過影響ACE2、AngII、Ang1-7的濃度抑制心肌重構(gòu)目前尚不明確。本研究通過觀察益母草堿治療后心肌重構(gòu)大鼠血清及左心室肌組織ACE2、AngⅡ、Ang1-7濃度的變化，進一步探討益母草堿抑制心肌重構(gòu)的可能作用機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物為SD雄性大鼠70只，由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，合格證號：SCXK(軍)2012-0011；試劑與儀器為異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司)，益母草堿(上海騰準生物科技有限公司)，DIZE(Sigma公司)，ACE2、Ang1-7ELISA試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)，AngⅡ ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，CTGF、FN免疫組化試劑盒(北京博奧森公司)，心臟超聲儀(PHILIPS-IE33)，酶標儀(北京新風機電公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，石蠟包埋機(LEICA-EG1150H)。

1.2方法 (1)動物分組及治療：70只健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量200±30g，在動物房同批飼養(yǎng)7 d后隨機分為正常組8只和實驗組62只。動物模型制備、分組及益母草堿給藥劑量參考前期研究[5]：以異丙腎上腺素(5 mg/kg/d)連續(xù)2w腹腔注射誘導(dǎo)大鼠心肌重構(gòu)模型，2周后實驗組存活大鼠55只，以心臟超聲評價心衰模型是否成功。將存活且造模成功大鼠50只隨機分五組：模型組、DIZE組、益母草堿低劑量組(低劑量組)、益母草堿中劑量組(中劑量組)、益母草堿高劑量組(高劑量組)，每組10只。各組干預(yù)治療方法：DIZE組予DIZE 15mg/kg/d腹腔注射，益母草堿低、中、高劑量組分別予益母草堿7.5 mg/kg/d、15 mg/kg/d及30 mg/kg/d腹腔注射，正常對照組和模型組給予相同體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，共干預(yù)治療2周。(2)試驗結(jié)束后以超聲心動圖檢查：以5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定，剃凈胸毛，以PHILIPS-IE33超聲儀，頻率12.0MHz超聲探頭檢測各組大鼠LVEDd、LVEDs、FS%、EF%，取3個連續(xù)心動周期測量平均值。(3)血清及心肌組織ACE2、AngⅡ、Ang 1-7含量檢測：采集頸動脈血，取血清于-70℃冰箱保存；處死大鼠，取心肌組織液氮凍存，將凍存的心肌組織按10 %(重量體積)加入預(yù)冷生理鹽水，快速剪碎，勻漿器碾磨，以4℃3 000r/min離心20min，取上清液于-70℃冰箱保存，同批與血清以ELISA法檢測各組ACE2及AngⅡ、Ang 1-7水平，操作按試劑盒說明進行。(4)HE染色：取左心室肌組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片后脫蠟，行HE染色，脫水封片，在顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)。(5)Masson染色：取左心室肌組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片后脫蠟，進行Masson染色，染色后心肌膠原纖維呈藍色，在顯微鏡下取5個視野平均值，用圖像分析軟件ImagePro Plus 6.0計算CVF值，CVF(%)=心肌膠原面積/照片面積×100%。(6)免疫組織化學法觀察左心室肌組織CTGF、FN的表達：取0.5×0.5 cm2大小左心室肌組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水、煮沸法修復(fù)，按照SP法免疫組化試劑盒說明操作，CTGF、FN一抗按1:300稀釋，PBS代替一抗作為空白對照。在顯微鏡下取5個視野平均值，用圖像分析軟件ImagePro Plus 6.0測量平均光密度，平均光密度(%)=積分光密度/照片面積×100%。

2 結(jié) 果

2.1心臟超聲檢測 結(jié)果與正常組比較，其他各組大鼠LVEDd、LVEDs值升高，而FS%、EF%值下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組LVEDd、LVEDs值明顯下降，而FS%、EF%值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，LVEDd、LVEDs、FS%、EF%在DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠心臟超聲檢測值

圖1 各組大鼠心臟超聲結(jié)構(gòu)變化

2.2心肌組織HE染色 正常組心肌細胞大小正常，排列規(guī)整，結(jié)構(gòu)清晰，細胞核大小形態(tài)正常，細胞間質(zhì)無水腫，無明顯纖維增生；模型組心肌細胞肥大，形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊，肌纖維溶解，細胞排列紊亂，見明顯纖維增生及炎性細胞浸潤；DIZE組及高劑量益母草堿組心肌細胞形態(tài)較清晰，排列較規(guī)整，纖維增生及炎性細胞浸潤明顯減少；而益母草堿低、中劑量組與模型組比較變化不明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色(×200)

2.3心肌組織Masson染色 經(jīng)Masson染色顯示心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍綠色，正常組細胞間無明顯膠原纖維沉積，心肌細胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰；模型組見大量膠原纖維增生，呈網(wǎng)狀交織、堆積成團成片，心肌細胞腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂；DIZE組及高劑量益母草堿組膠原纖維增生明顯減少，心肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較清晰。與正常組比較，其他各組大鼠CVF明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組CVF明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CVF在DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色(×200)

2.4心肌組織CTGF、FN蛋白質(zhì)表達水平的檢測 與正常組比較，其他各組大鼠心肌組織CTGF、FN蛋白質(zhì)表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組CTGF、FN蛋白質(zhì)表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；CTGF、FN在 DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖4-5。

表2 各組大鼠心肌組織CVF及CTGF、FN蛋白質(zhì)表達水平的檢測

圖4 各組大鼠心肌組織CTGF表達(×200) 圖5 各組大鼠心肌組織FN表達(×200)

2.5血清及左心室肌組織ACE2、AngⅡ、Ang 1-7含量檢測 與正常組比較，其他各組大鼠血清及左心室肌組織ACE2、AngⅡ、Ang1-7含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組ACE2、Ang1-7含量明顯升高，AngⅡ含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ACE2、AngⅡ、Ang 1-7在DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及心肌組織AngⅡ、ACE2、Ang 1-7的含量

3討 論

心肌重構(gòu)是多種心血管疾病發(fā)展至心力衰竭的基本病理機制，是在多種生長因子、激素刺激下出現(xiàn)的心肌細胞結(jié)構(gòu)及功能改變，主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、凋亡、細胞外基質(zhì)的過度纖維化[6]。生長因子CTGF可刺激成纖維細胞增殖及膠原沉積，促進心肌纖維化及心肌重構(gòu)[7]，F(xiàn)N是重要的細胞外基質(zhì)，也有促進心肌纖維化及心肌重構(gòu)的作用[8]，CTGF和FN是心肌纖維化的重要病理學標記物。

本研究通過異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌重構(gòu)大鼠模型，心臟超聲結(jié)果顯示其LVEDd、LVEDs升高，F(xiàn)S%、EF%下降，大鼠心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，心臟功能下降；HE染色見心肌細胞肥大或固縮、排列紊亂，Masson染色見膠原纖維明顯增生，免疫組化顯示CTGF、FN蛋白質(zhì)的表達水平明顯升高，從影像學及病理形態(tài)學提示造模成功。為觀察益母草堿對心肌重構(gòu)是否有抑制作用，本研究予益母草堿低、中、高劑量(7.5 mg/kg/d、15 mg/kg/d、30 mg/kg/d)進行干預(yù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量益母草堿干預(yù)后大鼠心臟LVEDd、LVEDs明顯下降，F(xiàn)S%、EF%明顯升高，提示高劑量益母草堿可改善心肌重構(gòu)大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能異常；經(jīng)HE染色和Masson染色結(jié)果顯示高劑量益母草堿組心肌組織心肌的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較清晰，膠原纖維增生明顯減輕，且免疫組織化學檢測顯示CTGF、FN蛋白質(zhì)的表達水平也明顯下降，提示高劑量益母草堿可改善大鼠心肌重構(gòu)病理形態(tài)學異常。本研究結(jié)果還顯示，高劑量益母草堿組大鼠血清及心肌組織AngⅡ含量明顯降低，而ACE2、Ang1-7含量明顯升高，綜合影像學、病理學檢查結(jié)果，與ACE2內(nèi)源性激動劑DIZE組效應(yīng)一致。心衰時RAS系統(tǒng)的激活是引起心肌重構(gòu)的重要原因，AngⅡ水平升高，可直接刺激心肌細胞增殖肥大和醛固酮分泌增加，進一步加重水鈉潴留、促進膠原合成及心肌纖維化。AngⅡ作為刺激因子，還可激活(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號通路，p38MAPK是MAPK信號通路的重要途徑，激活后可致心肌細胞肥大、細胞凋亡失調(diào)，引起炎性反應(yīng)、成纖維細胞活化，促進心肌重構(gòu)[9]。ACE2是2000年發(fā)現(xiàn)的RAS新成員，與ACE具有較高的同源性[10]，它是RAS系統(tǒng)重要的負調(diào)控因子，在心臟心肌細胞、成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞等均有表達，可催化AngⅡ生成Ang1-7，而Ang1-7與其特異性抗體Max結(jié)合發(fā)揮拮抗AngⅡ的生物學效應(yīng)[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，心力衰竭時ACE2水平升高，且心衰程度越重，ACE2水平越高，雖然ACE2升高，但同時ACE升高更加顯著，ACE/ACE2比值升高，ACE2不足以對抗ACE對心肌的毒害作用[13]。結(jié)合本研究模型組ACE2水平升高，推測在心肌重構(gòu)發(fā)生過程中，ACE2升高作為一種代償機制，刺激Ang1-7水平進一步升高，但此時升高的水平不足以對抗ACE-AngⅡ-AT1軸的不利作用。DIZE作為ACE2的內(nèi)源性激活劑，本實驗予DIZE干預(yù)治療后，ACE2及Ang1-7水平進一步升高，產(chǎn)生了可以和ACE-AngⅡ-AT1軸相平衡的效應(yīng)，心肌重構(gòu)得以改善，高劑量益母草堿具有和DIZE相同的干預(yù)治療效果。

現(xiàn)有的研究證實，Ang1-7抑制MAPK信號通路，降低心肌組織p38MAPK的蛋白磷酸化水平[14]，從而抑制心肌重構(gòu)[15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高劑量益母草堿可通過抑制p38MAPK信號通路逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)[5,16,17]，結(jié)合本研究結(jié)果及前期研究，推測高劑量益母草堿抑制大鼠心肌重構(gòu)，其機制可能與升高ACE2水平轉(zhuǎn)化AngII生成Ang1-7，進而抑制p38MAPK信號通路活化有關(guān)，具體機制有待進一步研究。