姜珊 張建偉

【摘要】 目的：觀察促排卵小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜成熟度及IL-6 mRNA表達(dá)。方法：選擇健康性成熟昆明種雌性小鼠20只，隨機(jī)數(shù)字表法分為觀察組和空白組，檢栓第4天（D4）比較兩組小鼠子宮內(nèi)膜成熟度及IL-6 mRNA表達(dá)。結(jié)果：觀察組種植窗期子宮內(nèi)膜成熟度低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=5.051，P=0.025）;觀察組IL-6 mRNA表達(dá)水平低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.164，P=0.044）。結(jié)論：促排卵小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜發(fā)育較正常小鼠延遲，成熟度及IL-6 mRNA表達(dá)降低。

【關(guān)鍵詞】 小鼠 促排卵 子宮內(nèi)膜 種植窗期 白細(xì)胞介素-6

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.27.061 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）27-0-02

[Abstract] Objective： To observe the endometrial maturity and the expression of IL-6 mRNA in the implantation window of ovulation promoting mice. Method： Twenty healthy and sexually mature Kunming mice were selected， and were randomly divided into the experimental group and the blank group. The mice were killed off in the morning of the 4th day （D4） after being found having vaginal suppository. The endometrial maturity and the expression of IL-6 mRNA were compared. Result： The endometrial maturity in the observation group was lower than that in the blank group， the difference was statistically significant （字2=5.051， P=0.025）. The expression level of IL-6 mRNA in the observation group was lower than that in the blank group， the difference was statistically significant （t=-2.164， P=0.044）. Conclusion： The development of endometrium is delayed， the maturity and the expression of IL-6 mRNA are decreased when ovulation promoting mice are at implantation window.

[Key words] Mice Ovulation induction Endometrium Implantation window IL-6

First-authors address： Shandong First Medical University， Jinan 250062， China

圍著床期子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性是生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。助孕治療應(yīng)用的各種促排卵藥物，使人體內(nèi)環(huán)境失衡，可能對子宮內(nèi)膜的容受性存在負(fù)面影響[1-4]。本研究觀察促排卵藥物對小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜組織形態(tài)及白細(xì)胞介素-6（Interleukin- 6，IL-6）mRNA的表達(dá)變化，為促排卵臨床方案優(yōu)化提供參考，具體如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF（specific pathogen free）級昆明種雌性小鼠（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）20只，雄性小鼠10只，8～9周齡，體重（35±5）g。

1.1.2 藥物 注射用尿促性素（human menopausal gonadotropin，HMG，麗珠集團(tuán)麗寶生物化學(xué)制藥公司，75 IU/支，國藥準(zhǔn)字H10940097）;注射用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，麗珠集團(tuán)麗寶生物化學(xué)制藥公司，2 000 U/支，國藥準(zhǔn)字H44020674）。

1.1.3 試劑 梯度酒精（75%、80%、95%、100%）、蘇木素-伊紅液、10%中性甲醛液、二甲苯、中性樹膠、去RNase水、2 mol/L NaOAc（pH=4.0）、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U/μl、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（RT reaction buffer）、Taq DNA聚合酶1 U/μl、PCR反應(yīng)體系（PCR reaction buffer）、GIT變性液、1.5%瓊脂糖凝膠。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 眼科手術(shù)器械、體視鏡（LEICA GZ6）、-80 ℃超低溫冰箱（日本SANYO）、倒置顯微鏡（OLYMPAS CK 40-32ph）、脫水機(jī)（ZT-12P）、展片機(jī)（ZPJ-1A）、XK96-A型快速混勻器（江蘇省新康儀器廠）、EC250-90多功能電泳儀（EC公司）、PTC-150型PCR擴(kuò)增儀（美國MJ Research公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 20只雌性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為觀察組和空白組，每組10只。每籠5只飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度20 ℃～22 ℃，相對濕度50%，控制12 h光照，12 h黑暗。

1.2.2 給藥方法 參照文獻(xiàn)[5]建立促排卵小鼠模型，以HMG/HCG聯(lián)合方案進(jìn)行。連續(xù)觀察2個動情周期后，于上午9點(diǎn)行陰道涂片檢查為動情前期，觀察組于下午6點(diǎn)腹腔注射HMG 12 IU，空白組給予等量生理鹽水，48 h后觀察組小鼠腹腔注射HCG 12 IU，空白組仍給予等量生理鹽水。觀察組與空白組雌性小鼠均按雌∶雄=2∶1合籠飼養(yǎng)，待檢查雌性小鼠陰道出現(xiàn)陰栓時即為交配成功，此時對雌性小鼠進(jìn)行標(biāo)本采集，雄性小鼠則不參與后續(xù)標(biāo)本制作。

1.2.3 標(biāo)本采集 合籠次晨查有陰栓作為妊娠第1天（D1），檢栓第4天（D4）于上午9點(diǎn)脫頸處死小鼠，取出子宮角，修去宮頸。一側(cè)宮角置10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，切片厚度4 μm;擠壓法分離另一側(cè)子宮內(nèi)膜，置液氮中，轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱待檢。

1.2.4 小鼠子宮內(nèi)膜成熟度比較 光學(xué)顯微鏡檢測小鼠子宮內(nèi)膜組織，根據(jù)內(nèi)膜厚度、間質(zhì)疏松程度、血管及腺體形態(tài)學(xué)特征判斷子宮內(nèi)膜成熟度，觀察組及空白組進(jìn)行比較。

1.2.5 小鼠子宮內(nèi)膜IL-6 mRNA表達(dá)測定 采用RT-PCR

測定子宮內(nèi)膜IL-6 mRNA的表達(dá)。根據(jù)基因序列，參照MEDLINE PubMed nucleotide query進(jìn)行合成。IL-6引物序列：上游為5-TTGACAAACAAATTCGGTACA-3;下游為5-GAGGTGCCCATGCTACA-3;β-actin引物序列：上游為5-ATGGGTCAGAAGGACTCCTA-3，下游為5-ACGCTCGGTCAGGATCTTCAT-3。取子宮內(nèi)膜組織約100 mg，加入1 ml Trizol試劑，勻漿器充分勻漿，參照說明書提取總RNA。RT-PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 1 min;58 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min;共35個循環(huán)，其后72 ℃延長7 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠成像分析系統(tǒng)攝像測量，分析條帶灰度值，以IL-6 mRNA與內(nèi)參照β-actin mRNA的光密度值（IOD）的比值作為目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0軟件包行統(tǒng)計處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組種植窗期子宮內(nèi)膜成熟度比較

觀察組小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育成熟者3只，發(fā)育延遲者7只;空白組小鼠子宮內(nèi)膜發(fā)育成熟者8只，發(fā)育延遲者2只。觀察組種植窗期子宮內(nèi)膜成熟度低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組促排卵小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜IL-6mRNA表達(dá)比較

觀察組小鼠子宮內(nèi)膜IL-6 mRNA表達(dá)水平為0.45±0.15，空白組小鼠子宮內(nèi)膜IL-6 mRNA表達(dá)水平為0.61±0.17。觀察組IL-6 mRNA表達(dá)水平低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-2.164，P=0.044）。

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性是胚胎植入的重要保證，胚胎與子宮內(nèi)膜具有高度的時空特異性。借助定位、黏附、穿透過程，胚胎才能在子宮內(nèi)膜著床，而只有建立了容受性的種植窗內(nèi)膜才能接受胚胎植入[5-6]。促排卵作為助孕技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，使患者獲得多個可利用的卵子成為可能，臨床治療方案發(fā)展日新月異，然而種植率并不理想。研究表明，誘導(dǎo)排卵藥物的應(yīng)用，對內(nèi)膜有不同程度的負(fù)面影響，直接或間接干擾內(nèi)膜發(fā)育，并與胚泡發(fā)育不同步，而子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)的改變，與種植窗內(nèi)膜組織形態(tài)和相關(guān)分子水平變化有關(guān)，從而對助孕治療結(jié)局產(chǎn)生影響[7-8]。人IL-6分子量為21～26 kD，由184個氨基酸組成，是一種重要的多功能細(xì)胞因子，能促進(jìn)細(xì)胞增殖、黏附，是炎癥反應(yīng)的敏感標(biāo)記物，同時也是子宮內(nèi)膜種植窗期的重要的分子標(biāo)志物[9]。研究證實(shí)，不明原因不孕女性的子宮內(nèi)膜IL-6水平降低[10]。孕早期小鼠腹腔注射不同劑量的IL-6對小鼠子宮內(nèi)膜中白血病抑制因子（leukemia inhitory factor，LIF）mRNA及蛋白水平均有顯著上調(diào)作用，作用呈劑量依賴性，鑒于IL-6的生物學(xué)特性及其在胚泡著床過程中的特異表達(dá)，它可能通過旁/自分泌作用參與子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)[11-12]。

本研究顯示HMG促排卵小鼠光鏡下內(nèi)膜腺體和間質(zhì)發(fā)育非同步化，部分腺腔直而窄，甚至缺乏應(yīng)有的腺腔，內(nèi)膜成熟度明顯延遲，與空白組小鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且子宮內(nèi)膜IL-6 mRNA表達(dá)低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示HMG促排卵對小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜發(fā)育存在不良影響，這可能是臨床促排卵治療出現(xiàn)高排卵率低妊娠率的原因之一。

綜上所述，借助小鼠動物實(shí)驗(yàn)，由分子水平探討促排卵對子宮內(nèi)膜成熟度及IL-6 mRNA表達(dá)的影響，為促排卵下的胚泡著床機(jī)制提供依據(jù)。然而胚胎著床影響因素繁雜，IL-6在子宮內(nèi)膜的定位及相關(guān)的通信網(wǎng)絡(luò)及信號通路有待深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]章漢旺，高娟.控制性超排卵小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜容受性的研究[J].中國婦幼保健，2005，20（11）：1324-1326.

[2]宮慧君，何碧嫦，周惠芳.子宮內(nèi)膜容受性治療進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2020，22（1）：177-180.

[3]梁毓，李穎，蘭永連，等.不孕原因?qū)Υ翱谄谧訉m內(nèi)膜Th1/Th2細(xì)胞因子的影響[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016，24（6）：33，60-64，133.

[4] Bourdiec A，Martel V，Akoum A，et al.Synchronous regulation of the determinants of endometrial receptivity to interleukin 1 at key stages of early embryo implantation in vivo[J].Fertility and sterility，2014，101（4）：1183-1193.

[5]郭新宇，李海霞，謝妍，等.自然排卵、促排卵和超促排卵狀態(tài)下小鼠卵巢組織中生長分化因子-9（GDF-9）的表達(dá)[J].生殖與避孕，2013，33（1）：1-5.

[6]李芷舒，魯海鷗，張宇明，等.不孕患者移植當(dāng)日子宮內(nèi)膜容受性評估對臨床妊娠率影響研究[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2020，36（3）：264-266.

[7] Vidal C L.GnRH antagonist for endometrial priming in an oocyte donationprogramme：a prospective，randomized controlled trial[J].Reprod Biomed Online，2018，37（4）：415-424.

[8]冼英杰，陳彩蓉，梁小青，等.促排卵藥物對小鼠子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志物表達(dá)的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2019，16（12）：1724-1726.

[9] Moberg C，Bourlev V，Ilyasova N，et al.Endometrial expression of LIF and its receptor and peritoneal fluid levels of IL-1α and IL-6 in women with endometriosis are associated with the probability of pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet，2015，292（2）：429-437.

[10] Prins J R，Gomez-Lopez N，Robertson S A.Interleukin-6 in pregnancy and gestational disorders[J].Reprod Immunol，2012，95（1-2）：1-14.

[11]張煒，周劍萍，劉銀坤，等.細(xì)胞因子對白血病抑制因子在小鼠孕早期子宮內(nèi)膜表達(dá)的調(diào)節(jié)[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2000，9（4）：225-229.

[12]張麗，馬彩虹，張馨雨，等.子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕女性卵泡液細(xì)胞因子表達(dá)水平的研究[J].中華生殖與避孕雜志，2018（12）：986-999.

（收稿日期：2020-04-01） （本文編輯：馬竹君）