佟盼盼 楊銀萍 謝金鑫 張萌萌 張 凌 唐雪林 張 毅 蘆 星 蘇戰(zhàn)強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

我國(guó)寵物的擁有數(shù)量呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，據(jù)《2019年中國(guó)寵物行業(yè)白皮書》(消費(fèi)報(bào)告)數(shù)據(jù)顯示：預(yù)測(cè)到2024年，我國(guó)寵物犬、貓擁有數(shù)量達(dá)2.48億只，犬、貓儼然成為伴侶動(dòng)物中的主流。研究表明犬、貓已成為致人類腸道和腸外感染的大腸桿菌的儲(chǔ)存庫(kù)[1]。由于寵物臨床的不規(guī)范用藥導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性日趨嚴(yán)重[2]，甚至出現(xiàn)了對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的現(xiàn)象[2-3]。β-內(nèi)酰胺類抗生素應(yīng)用廣泛，屬于一線抗菌藥物，大腸桿菌對(duì)該類抗生素耐藥主要依賴于質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，其中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)受到廣泛關(guān)注[3-4]。

寵物攜帶耐藥大腸桿菌不但影響治療效果，且潛在從寵物傳播到人類的風(fēng)險(xiǎn)[2-3,5]。目前，國(guó)外已報(bào)道寵物可將耐藥大腸桿菌傳染給人類，嚴(yán)重威脅人類的健康[3,6]。近年來(lái)我國(guó)廣大科研工作者對(duì)細(xì)菌耐藥性及傳播機(jī)制做了大量的研究，主要集中在食源性大腸桿菌[7-8]，僅有幾個(gè)省份報(bào)道了寵物源大腸桿菌的耐藥情況[9-13]，其中很少有關(guān)新疆地區(qū)寵物源產(chǎn)ESBLs大腸桿菌的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)。因此，本研究旨在對(duì)烏魯木齊市犬、貓?jiān)创竽c桿菌進(jìn)行耐藥性分析，并對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因檢測(cè)，以期為指導(dǎo)寵物臨床合理用藥提供理論依據(jù)，同時(shí)為ESBLs在細(xì)菌中的流行病學(xué)和進(jìn)化提供有價(jià)值的信息。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

從2018年9月—2019年6月，從烏魯木齊市2家寵物醫(yī)院收集犬、貓肛拭子樣品，在采樣過(guò)程中接受體檢和接種疫苗的犬、貓記錄為健康寵物；出現(xiàn)體溫升高、食欲不振、精神萎靡，伴隨嘔吐、腹瀉等臨床癥狀的犬、貓記錄為患病寵物。共采集肛拭子樣品181份，包括犬源114份(健康犬33份，患病貓81份)，貓?jiān)?7份(健康貓19份，患病貓48份)。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

抗生素藥敏紙片氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林-他唑巴坦、氨芐西林-舒巴坦、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氯霉素、多粘菌素和鏈霉素購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液肉湯(BHI)、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、麥康凱瓊脂(MAC)、MH瓊脂(MHA)購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；科瑪嘉尿道定位顯色培養(yǎng)基購(gòu)自上海欣中生物工程有限公司；質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 大腸桿菌的分離鑒定

向裝有肛拭子樣品的采集管中加入2 mL 0.85%生理鹽水，室溫震蕩混勻10 min，靜置3 min，取10 μL混懸液加入BHI培養(yǎng)基中增菌，37 ℃，培養(yǎng)16 h。將增菌液劃線接種MAC平板，37 ℃，培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài)，每塊平板上挑取疑似大腸桿菌單菌落劃線接種科馬嘉尿道定位顯色培養(yǎng)基平板，37 ℃，培養(yǎng)16 h，取單菌落置于TSB中，37 ℃，培養(yǎng)16 h，利用大腸桿菌16S rDNA特異性引物(F:5’-GCGGACGGGTGAGTAATGT-3’和R:5’-TCATCCTCTCAGA CCAGCTA-3’，生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司合成)進(jìn)行PCR鑒定[14]，陽(yáng)性菌置于20%甘油的生理鹽水中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥物敏感性檢測(cè)

采用K-B藥敏紙片法對(duì)寵物源大腸桿菌分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2016版執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，判定結(jié)果為耐藥(Resistance，R)、中介(Intermediate，I)或敏感(Susceptible，S)[15]。

1.5 ESBLs表型檢測(cè)

通過(guò)雙紙片協(xié)同試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)ESBLs菌株，同時(shí)使用頭孢他啶(30 μg)和頭孢他啶/克拉維酸(30/10 μg)及頭孢噻肟(30 μg)和頭孢噻肟/克拉維酸(30/10 μg)2對(duì)藥敏紙片，當(dāng)頭孢他啶和頭孢噻肟中有任何一個(gè)，在加克拉維酸后，抑菌環(huán)直徑與不加克拉維酸的抑菌環(huán)相比，增大值≥5 mm時(shí)，判定為產(chǎn)ESBLs[15]。大腸桿菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌。

1.6 ESBLs耐藥基因檢測(cè)

采用煮沸裂解法提取分離株總DNA作為PCR模板，提取本實(shí)驗(yàn)室保存的攜帶ESBLs耐藥基因的菌株總DNA作為PCR陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)參考文獻(xiàn)[16-19]合成ESBLs耐藥基因，包括CTX-M(CTX-M-1G、CTX-M-2G和CTX-M-9G)、TEM和SHV，引物(表1)均由上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，根據(jù)不同擴(kuò)增基因調(diào)整退火溫度。

表1 檢測(cè)耐藥基因的引物序列Table 1 Sequences of primers used to screen resistance gens

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素分析采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 寵物源大腸桿菌的分離鑒定結(jié)果

犬、貓肛拭子樣品增菌后劃線接種麥康凱平板，疑似大腸桿菌呈深桃紅色、圓形、扁平，邊緣光滑(圖1(a))，挑取單菌落在科馬嘉尿道定位顯色培養(yǎng)基上純化(圖1(b))，經(jīng)大腸桿菌特異性PCR鑒定(圖2)，從181份犬、貓肛拭子中共獲得120株(66.3%)大腸桿菌，包括犬源71株，貓?jiān)?9株。

圖1 寵物源大腸桿菌分離株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of E.coli isolates from pets

M, DNA標(biāo)記DL 2 000; N, 陰性對(duì)照; 1,陽(yáng)性對(duì)照E.coli 25 922; 2～4, 大腸桿菌分離株M, DNA Marker DL 2 000; N, negative control;1, E.coli 25 922 as positive control; 2-4, E.coli isolates圖2 寵物源大腸桿菌分離株16S rDNA PCR擴(kuò)增Fig.2 Amplification of 16S rDNA of E.coli isolates from pets by PCR

2.2 寵物源大腸桿菌的藥物敏感性

由表2可知，120株犬、貓?jiān)创竽c桿菌對(duì)19種藥物均表現(xiàn)出了耐藥性，對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、復(fù)方新諾明和哌拉西林的耐藥率在35.8%～60.8%；對(duì)頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星和多粘菌素6種藥物的耐藥率在10.0%～29.2%；對(duì)亞胺培南、左氧氟沙星、阿米卡星、頭孢他啶、氨曲南、氨芐西林-舒巴坦、阿莫西林、頭孢吡肟和美羅培南的耐藥率在0.8%～10.0%；這些分離株對(duì)哌拉西林-他唑巴坦完全敏感。經(jīng)雙紙片協(xié)同試驗(yàn)后，35株(29.2%)大腸桿菌為產(chǎn)ESBLs菌株。這些大腸桿菌對(duì)鏈霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率，患病犬高于健康犬，而患病貓低于健康貓，差異顯著(P<0.05)。與患病貓相比，健康貓?jiān)创竽c桿菌對(duì)阿米卡星的耐藥率更高。

表2 寵物源大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性Table 2 Antimicrobial sensitivity of E.coli strains isolated from pets

2.3 寵物源大腸桿菌多重耐藥性

20種抗生素包括四環(huán)素類、氨基糖苷類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、喹諾酮類及多肽類共7類。多重耐藥的表型定義為同時(shí)對(duì)≥3類抗生素耐藥[20]。寵物源大腸桿菌多重耐藥表型的檢出率為48.3%(58/120)。如圖3所示，犬源和貓?jiān)捶蛛x株中均存在多重耐藥表型，且差異不顯著(P>0.05)，犬源分離株主要對(duì)3類抗生素產(chǎn)生耐藥(16.9%，12/71)，貓?jiān)捶蛛x株主要對(duì)4類抗生素產(chǎn)生耐藥(18.4%，9/49)；對(duì)6類抗生素耐藥菌株的分離率，患病犬顯著高于健康犬(P<0.05)，而健康貓顯著高于患病貓(P<0.05)。58株多重耐藥菌對(duì)3～14種抗生素耐藥，其中分離自患病寵物的2株大腸桿菌對(duì)14種抗生素耐藥，與健康寵物相比，患病寵物大腸桿菌的耐藥譜型更豐富。在健康和患病犬中均分離到對(duì)7類抗生素耐藥的菌株，而貓?jiān)捶蛛x株中不存在這樣的菌株。

0R、1R、2R、3R、4R、5R、6R和7R：0、1、2、3、4、5、6和7類結(jié)構(gòu)不同抗菌藥物同時(shí)耐藥；*表示顯著差異，P<0.05。0R、1R、2R、3R、4R、5R、6R和7R refer the resistance of E.coli strain to 0,1,2,3,4,5,6, and 7 of different structure antibacterial drugs；*：Significant difference, P<0.05.圖3 大腸桿菌分離株多重耐藥菌株所占百分比Fig.3 Percentage of multidrug resistant strains of E.coli isolates

2.4 寵物源大腸桿菌ESBLs耐藥基因檢測(cè)

對(duì)35株產(chǎn)ESBLs分離株進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶基因CTX-M、TEM和SHV檢測(cè)，如圖4所示，22株(62.9%)至少攜帶一種β-內(nèi)酰胺酶基因，CTX-M(593 bp)和TEM基因的攜帶率分別為54.3%(19/35)和34.3%(12/35)，其中CTX-M-1G(1 018 bp)和CTX-M-9G(870 bp)基因攜帶率分別為40.0%(14/35)和28.6%(10/35)，5株同時(shí)檢測(cè)到CTX-M-1G和CTX-M-9G基因，9株同時(shí)攜帶CTX-M和TEM基因(表3)，未檢測(cè)到CTX-M-2G和SHV基因。

M, DNA標(biāo)記DL 2 000; N, 陰性對(duì)照; 1, 陽(yáng)性對(duì)照; 2和3, 大腸桿菌分離株M, DNA Marker DL 2 000; N, negative control;1, positive control; 2 and 3, E.coli isolates圖4 大腸桿菌分離株β-內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增Fig.4 Amplification of β-lactamase genes of E.coli isolates by PCR

表3 35株產(chǎn)ESBL菌株的β-內(nèi)酰胺酶基因分型Table 3 Genotyping of β-lactamase gene of the 35 ESBL-producing isolates

3 討論與結(jié)論

3.1 寵物源大腸桿菌的耐藥情況

伴侶動(dòng)物耐藥菌的產(chǎn)生和流行受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注[9-13,21-23]。近年來(lái)從寵物中分離出越來(lái)越多的多重耐藥大腸桿菌，這些菌攜帶的耐藥基因可在人類和動(dòng)物之間進(jìn)行水平傳播[22]。成年犬、貓感染致病性大腸桿菌可導(dǎo)致腎盂腎炎和尿道炎，患病犬、貓與人類接觸可導(dǎo)致人類發(fā)生尿路感染[23]?；趯櫸锱c人類的親密關(guān)系，不僅國(guó)外重視研究寵物源大腸桿菌的耐藥問(wèn)題，在我國(guó)也有多個(gè)地區(qū)開展了針對(duì)寵物源大腸桿菌的耐藥性研究，包括吉林、成都、廣州和石河子等[9-12]，大量的研究發(fā)現(xiàn)寵物攜帶有大量的耐藥菌，但新疆地區(qū)關(guān)于此相關(guān)研究報(bào)道相對(duì)較少，因此，本研究對(duì)烏魯木齊市寵物源大腸桿菌進(jìn)行耐藥性研究具有重要意義。

本研究中寵物源大腸桿菌分離株對(duì)早期使用較多的抗生素如四環(huán)素和氨芐西林的耐藥較為嚴(yán)重，與吉林、石河子、廣州地區(qū)所報(bào)道的寵物源大腸桿菌的耐藥率相似均在50%以上[9,12-13]。這些分離株對(duì)臨床常見抗生素，如復(fù)方新諾明、哌拉西林、頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素等也存在不同程度耐藥。在同一類型的抗生素中，如鏈霉素(27.5%)和阿米卡星(7.5%)的耐藥率也存在一定差異。這種情況可能與臨床寵物醫(yī)生抗生素用藥習(xí)慣及用藥頻率有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)寵物源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為60.8%、51.7%、29.2%和14.2%，均低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)[9,12]。根據(jù)寵物醫(yī)院用藥情況發(fā)現(xiàn)，目前寵物適用的抗生素種類較多，促使大部分臨床寵物醫(yī)生在用藥方面有更多的選擇權(quán)。國(guó)外的研究結(jié)果顯示，澳大利亞寵物源大腸桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥率最高為9.3%，美國(guó)寵物源大腸桿菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高達(dá)23%；葡萄牙健康犬源大腸桿菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率最高為20%[24-26]。與國(guó)外相比，烏魯木齊市寵物源大腸桿菌的耐藥率更高，多重耐藥情況更嚴(yán)重。此外，從健康和患病寵物中均分離到多重耐藥大腸桿菌，與健康寵物相比，患病寵物大腸桿菌的耐藥譜型更豐富，寵物臨床上應(yīng)重視監(jiān)測(cè)大腸桿菌的耐藥性，慎用耐藥率高的抗生素。

3.2 寵物源大腸桿菌ESBLs耐藥基因的攜帶情況

超廣譜頭孢菌素，尤其是第三和第四代頭孢菌素，被世界衛(wèi)生組織和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為對(duì)人類和動(dòng)物極為重要的抗菌藥物[27]。大腸桿菌主要通過(guò)產(chǎn)生ESBLs實(shí)現(xiàn)對(duì)超廣譜頭孢菌素耐藥[4]。在本研究中發(fā)現(xiàn)29.2%寵物源大腸桿菌為產(chǎn)ESBLs菌株，高于國(guó)內(nèi)楊守深等[11]對(duì)廣州寵物的研究結(jié)果。本研究在35株耐頭孢噻肟的菌株中檢測(cè)到CTX-M和TEM型ESBLs，檢測(cè)率分別為 54.3%(19/35)和34.3%(12/35)，以CTX-M型ESBLs為主，且包含CTX-M-1G(40.0%)和CTX-M-9G(28.6%)，這與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果一致[24,28]。13株產(chǎn)ESBL菌株未檢測(cè)到CTX-M、TEM和SHV，表明這些菌株可能攜帶其他酶，降低了對(duì)三代頭孢菌素的敏感性[8]。

碳青霉烯類抗菌藥物是治療革蘭氏陰性菌感染的“最后一道防線”。值得注意的是，在藥敏試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)有9.2%的寵物源大腸桿菌分離株對(duì)亞胺培南耐藥，而且在1只幼齡布偶貓?bào)w檢的肛拭子中分離到1株對(duì)美羅培南和亞胺培南同時(shí)耐藥的菌株，這些菌株的耐藥基因有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，烏魯木齊市寵物源大腸桿菌對(duì)臨床常用抗生素的耐藥率在10.0%～60.8%，并出現(xiàn)了對(duì)碳青霉烯類耐藥的菌株，提示該地區(qū)寵物源大腸桿菌耐藥情況嚴(yán)重，應(yīng)重視產(chǎn)ESBLs大腸桿菌在寵物中流行的嚴(yán)峻形勢(shì)，慎用耐藥率高的抗生素，對(duì)防止耐藥基因在大腸桿菌中的廣泛播散具有重要意義。