魏廣輝，李執(zhí)，陳強，李陽，陳詩豪，裴英，周勇，程夢萍，唐豪，王際睿1,，魏育明1,，劉登才1,，陳黎，鄭有良1,，蒲至恩

（1西南作物基因資源發(fā)掘與利用國家重點實驗室，成都611130；2四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都611130；3四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所，成都611130；4宜賓市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，四川宜賓644000）

0 引言

【研究意義】人體需要 22種元素來維持身體健康，其中硒是構成含硒蛋白與含硒酶的重要組分，含硒復合物具有清除體內(nèi)自由基、抗衰老、增強人體免疫力、拮抗重金屬毒性等生物功能，近年來已成為國內(nèi)外研究的熱點[1-2]。中國是世界上缺硒最嚴重的國家之一，約有一億多人口膳食結構中硒含量不足。與動物性食品相比，植物性膳食中的硒相對含量較低[3-4]，其中，小麥作為人類的主要植物性膳食來源之一，籽粒中的硒含量與健康息息相關。在小麥中，硒主要以硒代蛋氨酸和甲基硒代半胱氨酸形式存在[5]，不同形態(tài)的硒對人體的作用不同[6]，而這兩種形式的有機硒對人體健康的有效性遠大于無機硒。故利用好小麥中的硒源是一條人體補硒的高效、低廉、簡單和易行的途徑，開展高硒小麥選育是克服硒元素缺乏的最經(jīng)濟有效方法之一。由于對硒元素檢測手段頗為復雜，限制了育種單位對這一性狀的選育，因此，有必要將控制小麥籽粒硒含量的基因或者標記開發(fā)成簡單、易操作的PCR標記來解決這一難題?！厩叭搜芯窟M展】隨著生物技術的發(fā)展，越來越多的分子標記用于育種[7-8]，目前，在基因組層面豐度最大的為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）[9]。并且 SNP已在很大程度上取代了已廣泛測序的作物品種（如小麥）的簡單序列重復序列（simple sequence repeats，SSR）用于分子標記輔助選擇。競爭性等位基因特異性 PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）可以針對指定的 SNP和 InDel（insertions and deletions，InDels）進行高精度雙等位基因分型。相比于其他的驗證技術，KASP具有更高的分析穩(wěn)定性和準確度、反應成本更低、通量更大，是一項優(yōu)質價廉的基因分型技術[10-11]。這項技術是基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP分型以及檢測InDels[12-13]。通過全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）與SNP標記聯(lián)合使用，可以挖掘出大量的重要農(nóng)藝性狀的相關位點，開發(fā)相關的KASP標記，可以快速方便地進行材料的選擇，包括在育種過程中對抗逆性、株高、穗長等性狀的直接選擇[14]。YU等[15]利用GWAS鑒定了小麥品系中與Ug99莖銹病抗性相關的基因座，標記特征關聯(lián)鑒定了12個與抗性顯著相關的SNP標記并開發(fā)了KASP標記，這些標記物可用于小麥對 Ug99莖銹病抗性的育種中的標記輔助選擇。ZENG等[16]在小麥條銹病基因的發(fā)掘中，對重組自交系中利用BSA后的SNP陣列進行了單倍型分析，并開發(fā)了用于標記輔助選擇的KASP標記用來進行條銹病的選擇。可見在小麥中利用 SNP標記開發(fā)的KASP標記用于分子標記輔助選擇是可行的。分子標記的廣泛應用同時推動了硒相關基因的定位研究，孫明茂[17]、張現(xiàn)偉[18]研究得到的水稻硒含量相關 QTL位點將用以對雜種后代的選擇改良；趙敏[19]通過篩選富硒基因型進行富硒大米及其農(nóng)產(chǎn)品的研究與開發(fā)；陳大清等[20]通過對擬南芥耐硒突變體的基因定位，挖掘硒耐受基因與硒敏感基因；裴英[21]通過圖譜構建得出小麥硒含量相關的QTL，利用高硒人工合成小麥資源SHW-L1與普通小麥品種川麥32雜交獲得重組自交系群體（RILs），利用SSR標記與DArT標記技術對F10代的RILs群體進行基因型檢測，構建了含有1 874個DArT標記和299個SSR標記、總長度3 985.6 cM 的遺傳圖譜。并結合多年多點對籽粒硒含量進行了定位，得到10個硒相關QTL位點，主要分布于3D、5A染色體?！颈狙芯壳腥朦c】利用SNP開發(fā)出的KASP標記篩選高硒小麥資源的研究仍鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用SHW-L1×川麥32重組自交系群體已有的660K小麥SNP圖譜芯片對RILs群體進行了圖譜密化，把位于5A染色體上的QTL區(qū)間進一步縮小，開發(fā)穩(wěn)定基因內(nèi)的SNP位點為KASP標記，用于高硒小麥材料的篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料總共152份，均來自四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所，其中人工合成小麥親本SHW-L1和川麥32及其衍生的含138個株系的RILs用于KASP標記開發(fā)。SHW-L1在溫江種植條件下的硒含量為0.1048 mg·kg-1，約3倍高于川麥32的硒含量0.0401 mg·kg-1[22-23]。通過前期利用SSR標記、DArT標記研究，發(fā)現(xiàn)與硒含量相關的QTL來源于SHW-L1[22-23]。為了驗證該標記的可靠性，選用了以人工合成小麥SHW-L1作為親本衍生出的如蜀麥969、蜀麥580、蜀麥980、蜀麥830、蜀麥114等14個品系用于驗證KASP標記。所有材料于2015、2016年分別種植于四川農(nóng)業(yè)大學崇州、溫江試驗生產(chǎn)基地，栽培措施同一般大田生產(chǎn)。其中用于SNP分型和硒含量表型匹配的重組自交系 2015年種植于溫江，表型選擇標準為地方標準GB/T 22499-2008[24]0.0400 mg·kg-1，籽粒硒含量大于0.0400 mg·kg-1的材料為高硒品系，籽粒硒含量低于0.0400 mg·kg-1的貧硒品系。后續(xù)用于KASP標記的驗證材料于2016年種植于崇州試驗基地，硒含量劃分標準根據(jù)當年籽粒硒含量平均值0.0130 mg·kg-1進行，大于 0.0130 mg·kg-1的材料為高硒。

1.2 SNP 圖譜

參考楊劍[25]的方法構建重組自交系660K SNP圖譜。

1.3 小麥籽粒硒含量測定方法

利用原子熒光法[26]對材料進行硒含量測定，由宜賓市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所檢測。

1.4 DNA 提取方法

采用改良的 CTAB法[27]方法提取幼苗新鮮葉片DNA，并且取1.5 μL DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳檢測純度。

1.5 引物合成與反應體系

利用 Primer5.0軟件（http://www.premierbiosoft.com/index.html），根據(jù) SNP標記側翼序列信息進行KASP引物的設計，并通過生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成。

KASP驗證條件：2條特異性正向引物3′末端堿基為SNP位點變異堿基（G或A），5′端分別加上FAM和HEX熒光序列標簽序列。引物的混合比例為AL1∶AL2∶R∶ddH2O=6∶6∶15∶23，PCR反應體系為1 μL DNA、5 μL KASP Mix（LGC Genomics,Hoddeston, UK）、0.08 μL Μgcl2、2.52 μL ddH2O 和1.4 μL混合引物。利用CFX96熒光定量儀進行檢測，PCR 反應程序為 94℃ 15 min；94℃ 20 s，61—55℃60 s，10個循環(huán)（touch-down，每循環(huán)降低0.6℃）；94℃ 20 s，55℃ 60 s，30 個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

利用 CFX96熒光定量儀配套軟件 BioRad CFX Manager的基因分型模塊，讀取各樣品不同熒光信號值，并分析基因型；采用 Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)的整理，SPSS 20.0進行方差分析，根據(jù)廣義遺傳力計算公式估算遺傳力。遺傳力計算公式[28]如下：

式中，Vg為品種的方差組分，Ve為殘差的方差組分，MSV為品種的均方，MST為年份的均方，MSVT為品種與年份互作的均方，MSE為誤差的均方，r為重復，l為年份。

2 結果

2.1 群體硒含量變異情況

通過對材料籽粒中的硒含量進行方差分析（表 1），可以看出，群體品種間籽粒硒含量的差異達到極顯著水平，不同年份間群體籽粒硒含量無顯著差異，根據(jù)方差估算出小麥籽粒硒含量廣義遺傳力為66%。

表1 群體籽粒硒含量方差分析Table 1 Variance analysis of RIL population selenium concentration

2.2 SNP 標記

通過對獲得的多態(tài)性SNP標記進行偏分離篩選，去除偏分離后共獲得142 430個SNP標記用于圖譜構建。SNP標記和DArT標記以及SSR標記整合后的遺傳圖譜全長共17 889.62 cM，包含121 222個有效標記?；谇捌诙ㄎ唤Y果，將控制硒含量的位點定位于3D、5A染色體上，由于3D染色體上標記密度不夠，因此，本研究重點關注5A染色體上的信息。5A染色體上有7 207個標記，總長度為1 114.86 cM，密度為0.155 cM/Locus。

2.3 KASP 標記的開發(fā)

將重組自交系籽粒Se含量和整合后的5A染色體圖譜進行計算，并將LOD閾值設為2，得到重組自交系在5A染色體上的QTL區(qū)域（表2）。

將得到的QTL與圖譜進行對照，以獲得一個更大的QTL區(qū)間，區(qū)間內(nèi)的SNP作為初篩選標記。根據(jù)SNP分型結果與籽粒硒含量數(shù)據(jù)進行比對再篩選（圖1），總共分為3種，A型、B型和缺失。理想中的標記應該為A型和B型分離，并以某個籽粒硒含量的材料為界限，完全分布于兩側，但完全符合的標記基本不存在，因此，要從初篩選的標記中做二次篩選，只需選出基因型聚類較好的標記即可，最終選出5個標記用于開發(fā)籽粒硒含量相關的KASP分子標記（表3）。根據(jù)5個標記設計引物（表4），其中如AX-1引物包括2條等位基因特異性正向引物AL1和AL2，一條共同的反向引物R。

表2 篩選過LOD值后的QTL結果Table 2 QTL results after screening LOD values

圖1 SNP分型與籽粒硒含量比對結果Fig. 1 SNP comparison of genotyping and grain selenium content

表3 所用SNP標記Table 3 SNP markers used in this study

表4 KASP引物及序列Table 4 KASP primers and sequences

2.4 KASP標記的初驗證

針對5個標記分別進行KASP-SNP分型測試（圖2），其中2個標記能夠將2種基因型樣本區(qū)分開，另外3個標記無法區(qū)分親本基因型，因此剔除。通過測試的2個標記用于后續(xù)詳細的測試。

2.5 標記AX-1、AX-2的KASP-SNP分型詳細結果

在 SNP熒光信號二維圖（圖 3）中可以看到，2種基因型之間的夾角較大，且各信號點的熒光信號值也比較高，因此分型效果較好。其中，代表親本人工合成小麥SHW-L1都是聚合在X軸的橙色信號點，親本川麥32都是聚合在Y軸的藍色信號點。利用基因型對材料進行分類，將對應的樣本與其已經(jīng)測出的硒含量進行比對（圖 4），其中 AX-1標記所對應 118個材料中鑒定為基因型低硒的為54個，平均籽粒硒含量為 0.0145 mg·kg-1，相對應的表現(xiàn)型中，50個材料為低硒，4個材料為高硒（＞0.0300 mg·kg-1），對低硒材料的選擇效率為92.6%；群體中利用AX-1標記鑒定為基因型高硒的有64個，但其中47個材料表現(xiàn)型為低硒，17個為高硒，平均籽粒硒含量為 0.0295 mg·kg-1，對高硒材料的選擇效率為 26.6%，2種基因型的材料籽粒硒含量存在顯著差異（F=4.84，P＜0.05）。AX-2標記所對應118個材料中鑒定為基因型低硒的為56個，平均籽粒硒含量為0.0141 mg·kg-1，其中52個材料表現(xiàn)為低硒，4個材料表現(xiàn)為高硒，對低硒材料的選擇效率為 92.9%；利用標記鑒定為基因型高硒的有62個，其中表現(xiàn)型中有45個為低硒，17個材料表現(xiàn)為高硒，平均籽粒硒含量為 0.0303 mg·kg-1，對高硒材料的選擇效率為 28.4%，2種基因型的材料籽粒硒含量存在顯著差異（F=5.43，P＜0.05）。

圖2 分子標記對不同籽粒硒含量樣本的初次KASP-SNP分型檢測Fig. 2 Initial KASP-SNP typing of selenium content samples from different grains by molecular markers

按照 0.0400 mg·kg-1的標準對群體表現(xiàn)型進行劃分，其中118個材料中僅有21份材料硒含量表現(xiàn)為高硒，表現(xiàn)型比例嚴重偏離1∶1，也不符合數(shù)量性狀的正態(tài)分布。其中不論AX-1標記還是AX-2標記對應高硒表現(xiàn)型材料均為17個，即表明高硒基因型和高硒表現(xiàn)型的匹配度達到81%。可見，在利用標記剔除低硒基因型后的剩余高硒基因型材料中，再利用標記進行篩選時效率會更高。

2.6 KASP 標記的檢驗

圖3 分子標記對Rils138群體籽粒硒含量的KASP-SNP分型Fig. 3 KASP-SNP typing of selenium content in grain of RILs 138 population by molecular markers

圖4 KASP標記AX-1和AX-2不同等位變異在118份材料中的分布Fig. 4 Distribution of KASP-labeled AX-1 and AX-2 alleles in 118 materials

為了驗證AX-1和AX-2能否用于其他相關高硒小麥的篩選，選取14個由SHW-L1衍生育成的材料測試籽粒含量，按照群體當年籽粒硒含量平均值（0.0130 mg·kg-1）進行了 KASP-SNP 分型測試，圖5為部分品種（系）硒含量結果。結果表明，標記能很好地區(qū)分高硒和低硒籽粒樣品，通過與籽粒硒含量表型數(shù)據(jù)對比（表 5），可以看出，各驗證材料的基因型與表型結果基本一致，可以認為開發(fā)出的2個標記對于利用人工合成小麥SHW-L1衍生出的小麥品種（系）均有篩選籽粒硒含量相對高低的作用。

3 討論

3.1 高硒KASP標記的開發(fā)利用

圖5 分子標記對不同驗證樣本籽粒硒含量的定性檢測Fig. 5 Qualitative detection of selenium content in grain of different validation samples by molecular markers

表5 部分供試材料分型檢驗結果與表型數(shù)據(jù)對比表Table 5 Comparison of typing test results and phenotypic data

硒是小麥籽粒中的微量元素，受基因型和環(huán)境的共同影響。在檢測手段不能普及的前提下，培育高硒品種存在測試手段和技術上的瓶頸，開發(fā)簡單、易操作分子標記用于快速篩選高硒小麥材料有助于高硒小麥品種的選育，本研究開發(fā)的標記將有助于育種人員開展高硒品種選育工作。

分子標記輔助育種如DArT標記、SSR標記已經(jīng)廣泛應用于小麥育種上，茍璐璐等[29]利用231個小麥產(chǎn)量與品質相關性狀的一致性QTL區(qū)段中的SSR標記，通過關聯(lián)分析揭示四川地方品種產(chǎn)量和品質相關性狀的遺傳特征，這些SSR標記位點和區(qū)段為通過分子標記輔助選擇手段利用和發(fā)掘四川小麥地方品種產(chǎn)量和品質優(yōu)異相關基因或區(qū)段提供了理論指導。之后基于SNP芯片開發(fā)的KASP標記也被用于對抗逆性、種質資源和種子純度等性狀的直接選育，如GmSNAP11- 5149分子標記應用于輔助抗大豆胞囊線蟲品種選育和抗病種質資源鑒定[30]；張利莎等[31]研究表明SNP標記能夠有效鑒定混雜度低至5%的麥芽樣品，且基于KASP技術的SNP標記可以滿足麥芽純度的快速定量檢測需要。可見SNP標記作為第三代分子標記，隨著其標記水平的提升和成本的降低，應用也越來越廣泛，用于構建遺傳圖譜和遺傳多樣性分析等，但在分子標記輔助選擇育種中的應用還不夠普遍化，在小麥品質育種上的應用更少，尤其是針對籽粒中含量很少的微量元素。

近年來，對于硒含量相關基因的定位還多停留在對QTL位點發(fā)掘階段，性狀的復雜性和分子標記實用性使高硒小麥育種進展緩慢。由于SNP技術的發(fā)展，本研究在前期研究的基礎上進一步深入，將前期定位于5A上的新QTL位點的區(qū)間進一步縮小，開發(fā)出基于SNP位點的KASP標記。本研究開發(fā)的2個KASP標記均來源于人工合成小麥SHW-L1，不僅能在人工合成小麥群體中起到鑒定籽粒硒含量相關基因型的作用，在以人工合成小麥為親本的其他后代材料中，也能有效區(qū)分高硒和貧硒材料。SHW-L1作為親本具有很好的配合力，衍生了一大批材料，本研究選擇的14個高代品種（系）驗證材料中，其中5個材料（文中列出的僅為審定或者即將審定的高代材料）能夠利用本標記進行有效區(qū)分高硒材料和低硒材料，且表型和基因型一致，可見該標記也可用于SHW-L1后代的篩選，快速鑒定其后代育種材料中籽粒硒含量的高低。隨著對人工合成小麥的研究越來越深入[32-34]，發(fā)現(xiàn)人工合成小麥的后代如川麥42，蜀麥969等具有氮素利用效率高等特點，人工合成小麥是否具有其他元素高效利用的特點還需要進一步關注，同時本研究也為元素高效利用的SNP標記開發(fā)提供了參考。

值得注意的是，在本研究中，無論是AX-1還是AX-2標記，將供試材料可以按照基因型分為2類，即高硒和低硒材料，AX-1標記高硒基因型與貧硒基因型比例為50∶54=1∶1.18，AX-2標記基因型比例為52∶56=1∶1.10，等位基因符合1∶1的分離比例。但按照表現(xiàn)型來劃分，高硒材料∶低硒材料=21∶97，低硒材料的數(shù)目遠遠多于高硒材料數(shù)目，表型嚴重偏離了基因型，即通過KASP標記無法直接篩選出所有的貧硒材料，或者只篩選出高硒材料，需要根據(jù)標記不同等位變異在群體中的分布來考慮篩選方法以提高篩選效率。因此可通過反向操作，直接篩選去掉貧硒基因型材料，即可以篩選一半表現(xiàn)型為貧硒的材料，這樣只會篩選掉極少部分高硒材料，以此來提升一倍的選擇效率。對于剩下的高硒基因型，由于其對高硒材料選擇效率不高，應當采取傳統(tǒng)育種方法，結合表型篩選。但同時需要明確的是，具有高硒含量的表現(xiàn)型材料中，有81%的材料具有高硒的基因型，也表明了試驗所得標記的可靠性。

高硒基因型的材料表現(xiàn)為低硒的表現(xiàn)型，即基因分型結果和表現(xiàn)型不匹配的現(xiàn)象在本研究中比較常見，可能有以下幾種原因：一是植物籽粒從土壤中獲取營養(yǎng)元素有3個步驟，吸收、轉運以及物質在各個器官的再分配。但由于土壤中硒濃度太低（土壤含硒量為 0.2600 μg·g-1），造成了材料吸收效率較低，進而引起籽粒硒積累量較低，但不排除這些具備高硒基因型的材料擁有高效吸收或者轉運的潛力，在土壤硒充足時，具備高硒基因型的材料的籽粒硒積累量可能會更高。由于各個高硒基因型材料間也存在吸收轉運能力的差異，因此高硒基因型中仍然會有高積累和低積累的材料存在；二是小麥籽粒硒含量是由多基因控制的數(shù)量性狀，位于5A的位點差異并不能完全覆蓋材料間硒含量的差異。本文推測這是基因型和表現(xiàn)型之間存在偏差的主要原因。

3.2 KASP標記的其他用途

現(xiàn)有研究表明，植物中硒元素不僅對植物生長有利，還能降低鎘等重金屬的吸收，因此開發(fā)高硒的KASP標記不僅在于小麥籽粒硒含量的提高，還可以起到“一因多效”的作用，即用于小麥低積累鎘和汞品種和品系的篩選?，F(xiàn)有研究表明單施Se可對Cd[35]、Hg[36]等重金屬起到鈍化作用，減少水稻對重金屬的積累，能有效降低水稻吸收Cd，阻控Cd向地上部以及籽實中的轉運。小麥中硒對鎘的抑制主要原因是硒能促進莖和根的生長，降低莖中鎘的濃度[37]，從而降低小麥籽粒中的鎘含量。另外在水稻中已有通過QTL聚合篩選高硒低鎘材料的報道[38-39]，這也為小麥富硒低鎘材料的選育提供了思路和成功范例，希望本研究開發(fā)的高硒KASP標記能成為小麥富硒低鎘品種選育的開端，為解決中國現(xiàn)存的部分土壤問題中鎘含量較高現(xiàn)實情況前提下提供小麥安全生產(chǎn)的新思路。

4 結論

開發(fā)的KASP標記AX-1和AX-2能夠區(qū)分來源于人工合成小麥群體以及人工合成小麥衍生品種或自交系籽粒硒含量基因型，并有效鑒定其籽粒硒含量的相對高低，可用于高硒小麥材料的篩選。