秦秀娟，祁靜靜，竇萬福，陳善春，何永睿，李強

（西南大學(xué)/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712）

0 引言

【研究意義】柑橘潰瘍?。╟itrus bacterial canker，CBC）是由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（Xanthomonas citrisubsp.citri，Xcc）引起的檢疫性病害，會導(dǎo)致柑橘樹木落葉、落果、產(chǎn)量和品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1-3]。傳統(tǒng)防治方法難以根治，會造成巨大的人力、物力投入并影響環(huán)境[4]。隨著柑橘轉(zhuǎn)基因體系的日趨成熟，通過分子育種的方法高效獲得抗?jié)儾∑贩N成為可能。通過將抗病基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入甜橙（Citrus sinensis）增加其抗?jié)儾〉哪芰5]。分子育種相比傳統(tǒng)雜交育種具有準(zhǔn)確、高效的特點，近年來得到快速發(fā)展，運用分子生物學(xué)技術(shù)培育抗?jié)儾「涕倨贩N也成為防治潰瘍病侵害最根本、最有效的方式，而準(zhǔn)確篩選候選基因是分子育種的關(guān)鍵[6]。植物應(yīng)對生物脅迫時會產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）以抑制病原體生長，或作為植物早期防御反應(yīng)中的信號分子誘導(dǎo)下游抗性基因表達[7]?；钚匝踝鳛橹参矬w內(nèi)參與脅迫反應(yīng)和調(diào)控植物生長發(fā)育的重要物質(zhì)，其化學(xué)性質(zhì)活潑、具備較強的氧化活性[8]。在植物體內(nèi)產(chǎn)生機制多樣，主要由植物呼吸爆發(fā)氧化酶（respiratory burst oxidase homologue，Rboh，又稱NADPH氧化酶）介導(dǎo)生成[9-10]。研究呼吸爆發(fā)相關(guān)基因的功能與調(diào)控機理是發(fā)掘潛在抗?jié)儾『蜻x基因的重要途徑。Rboh是參與植物活性氧產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，因此，以柑橘為材料，基于全基因組數(shù)據(jù)，對 Rboh家族進行鑒定、信息學(xué)和誘導(dǎo)表達分析，挖掘抗柑橘潰瘍病相關(guān)成員，對于抗病育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物Rboh蛋白N端區(qū)域含有保守的Ca2+結(jié)合EF手性模體結(jié)構(gòu)，在調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性產(chǎn)生活性氧中起到重要作用[11]。當(dāng)細胞受到激素、病原等刺激時，細胞產(chǎn)生 Ca2+與Rboh的EF結(jié)構(gòu)結(jié)合后激活該酶，使之催化產(chǎn)生大量活性氧。植物Rboh以多基因家族形式存在，因Rboh在抵御脅迫方面的重要功能，越來越多的研究聚焦該家族。從第一個Rboh基因在水稻中被克隆出來后[12]，Rboh家族陸續(xù)在擬南芥[13]、番茄[14-15]、煙草[16-19]、馬鈴薯[20-21]、玉米[22]、西瓜[23]、大麥[24-25]、苜蓿[26]和豌豆[27]等植物中得以鑒定和分析，揭示了不同物種該家族的進化和表達特性，為功能研究和機理探索提供了可能。當(dāng)前，也有很多關(guān)于 Rboh在抵御脅迫中的功能研究。在擬南芥和煙草等模式植物中研究發(fā)現(xiàn)，該酶介導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧參與了植物的逆境脅迫[10]；YOSHIOKA等研究發(fā)現(xiàn)，NbRbohA和NbRbohB在煙草抗病反應(yīng)中參與了 H2O2的生成和抵抗致病霉菌（Phytophthora infestans）[18]；花葉病毒處理煙草葉片后可增加Rboh酶活性，從而經(jīng)一系列反應(yīng)促進H2O2的產(chǎn)生，且水楊酸（salicylic acid，SA）處理可增加NbRbohB的轉(zhuǎn)錄水平，最終誘導(dǎo)H2O2的大量積累[28]；擬南芥中茉莉酸（jasmonic acid，JA）可誘導(dǎo)AtRbohD和AtRbohF表達升高，并伴隨H2O2的積累；茉莉酸處理AtRbohD與AtRbohF雙突變體后，H2O2并未明顯上升[29]；李業(yè)等分別利用水楊酸、茉莉酸甲酯（MeJA）和稻黃單胞菌稻致病變種（Xanthomonas oryzaepv.oryzae，Xoo）PX099 處理水稻秧苗，均提高了OsRboh家族部分成員表達量，并伴隨H2O2的積累[30]；脫落酸（abscisic acid，ABA）處理玉米幼苗，ZmRbohA-D的表達量和活性氧產(chǎn)量均顯著升高，表明玉米 Rboh參與了脫落酸誘導(dǎo)的信號途徑[31]?！颈狙芯壳腥朦c】植物 Rboh受病原體和植物抗病相關(guān)激素的誘導(dǎo)，重建活性氧的平衡，進而調(diào)控植物對脅迫的抗性。前期對潰瘍病菌誘導(dǎo)易感與抗病柑橘品種后的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）研究發(fā)現(xiàn)，部分 Rboh家族基因差異明顯，這為深入挖掘和研究該家族與柑橘潰瘍病抗性提供了依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定并分析柑橘 Rboh家族，探索各成員在生物脅迫信號途徑相關(guān)激素和柑橘潰瘍病菌誘導(dǎo)下的應(yīng)答模式，分析其與柑橘潰瘍病發(fā)生的相關(guān)性，挖掘有潛力的候選基因用于抗?jié)儾》肿佑N。

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌體

2019年6月在西南大學(xué)溫網(wǎng)室和國家柑桔品種改良中心育種圃（坐標(biāo)：19°51′N，106°37′E）選取晚錦橙（Wanjincheng）和四季橘（Calamondin）葉片為材料進行誘導(dǎo)表達分析。供試潰瘍病菌為西南大學(xué)柑桔研究所保存的柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種A株系[2]。

1.2 CsRboh 家族鑒定

甜橙基因組和蛋白組數(shù)據(jù)下載于 Phytozome（ https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）[32]和CAP 數(shù)據(jù)庫（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）[33-34]。采用三步法對柑橘Rboh家族進行序列注釋[35]。首先，從 RedOxiBase（https://peroxibase.toulouse.inra.fr/）[9,36]獲取擬南芥 Rboh蛋白序列，與柑橘蛋白序列文件比對獲得柑橘 Rboh蛋白序列；去掉錯誤和重復(fù)并從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢測 EST（expressed sequence tag）支持，對上述錯誤進行校正；最終得到的 Rboh蛋白序列利用SCIPIO[37]獲得相應(yīng)染色體定位、基因和基因編碼序列（CDS）。鑒定過程中使用蛋白質(zhì)功能域分析工具 Pfam[38]和柑橘基因組變異數(shù)據(jù)庫（CitGVD）[39]對其進行功能注釋。

1.3 CsRboh 信息學(xué)分析

使用 ExPASy Proteomics Server（http://web.expasy.org/protparam/）分析 Rboh理化性質(zhì)[40]；CELLO[41]（http://cello.life.nctu.edu.tw/）預(yù)測亞細胞定位；MEGA 7.0[42]分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（最大似然法，maximum likelihood method）；GSDS[43]（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）和Mapchart展示Rboh基因結(jié)構(gòu)和染色體定位；MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）[44]分析 Rboh 蛋白保守基序；PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白二級結(jié)構(gòu)；Pfam（http://pfam.xfam.org/）[38]分析功能結(jié)構(gòu)域；PLANTCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動子順式作用元件。

1.4 植物激素和柑橘潰瘍病菌誘導(dǎo)處理

根據(jù) LI等[45]的方法對晚錦橙和四季橘葉片進行處理，簡述如下：采集成熟葉片（約3月齡）用75%的乙醇消毒后置于無菌培養(yǎng)皿；注射接種潰瘍病菌菌液（OD600=0.5）；于28℃光照培養(yǎng)；分別于0、12、24、36和48 h切取接種部位。葉圓片（直徑7 mm）分別浸泡于茉莉酸（100 μmol·L-1）、脫落酸（100 μmol·L-1）、水楊酸（10 μmol·L-1）溶液和無菌水（對照）置于28℃光照培養(yǎng)，0、12、24、36和48 h取樣。

上述樣品使用RNA提取試劑盒提取總RNA（艾德萊，北京），使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測各樣品中基因的相對表達量。

1.5 qRT-PCR 與統(tǒng)計分析

使用 NCBI Primer Blast根據(jù)CsRboh和柑橘內(nèi)參基因CsActin（GenBank：GU911361.1）特異性區(qū)域設(shè)計qRT-PCR引物（表1）。利用ChamQTMUniversaL SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊，南京）將潰瘍病菌、激素處理的葉片cDNA分別進行實時定量檢測。每個處理進行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)；相對表達量采用 2-ΔΔCt法計算（ΔCt=CtCsKat01-CtCsActin）[46]；使用SPSS V25（IBM，美國）進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 CsRboh家族鑒定和理化性質(zhì)

對柑橘全基因組范圍內(nèi) Rboh家族進行了鑒定和理化性質(zhì)分析，最終從柑橘基因組中鑒定到7個Rboh成員。這些基因編碼蛋白的長度在 784（CsRboh07）—946（CsRboh01）aa；其分子量變化范圍為89 837.0—106 370.8 Da；等電點（PI）分布在 8.67（CsRboh05）—9.40（CsRboh01），均為堿性蛋白；該家族基因編碼的蛋白質(zhì)親水性平均值分布在-0.015（CsRboh07）—-0.299（CsRboh02），除CsRboh07外，其他成員均為親水性蛋白。CsRboh04編碼的氨基酸脂肪指數(shù)最低（82.61），CsRboh07的最高（89.06），其余脂肪指數(shù)分布在 83.84—87.68。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)分布在40.42—50.16，其中CsRboh01最不穩(wěn)定。經(jīng) CELLO分析，柑橘CsRboh在細胞內(nèi)膜（CsRboh04、CsRboh06和CsRboh07）、細胞外膜（CsRboh01和CsRboh03）、細胞質(zhì)（CsRboh02和CsRboh05）均有分布（表2）。

二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、伸展鏈和不規(guī)則卷曲構(gòu)成，且主要以α-螺旋為主（41.83%—44.61%），其次是不規(guī)則卷曲（34.87%—38.29%），占比較少的為伸展鏈（13.85%—16.28%）和β-轉(zhuǎn)角（4.19%—5.48%）（表3）。柑橘Rboh家族各序列信息已提交至RedOxiBase數(shù)據(jù)庫[9]，其登錄號為13472—13476、13487—13488。

表2 CsRboh家族成員信息Table 2 The information of CsRboh family

2.2 CsRboh家族系統(tǒng)進化分析

為了研究 Rboh家族在多個物種中的進化關(guān)系，使用最大似然法構(gòu)建了包含柑橘、擬南芥和楊樹3個物種Rboh家族的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 1）。根據(jù)系統(tǒng)進化樹，3個物種的27個Rboh蛋白（柑橘7個、擬南芥10個、楊樹10個）可劃分為I—IV 4個亞家族，其中I亞家族又可以分為A、B兩個分支。4個亞家族分別包含3、2、1和1個柑橘Rboh成員。值得注意的是第IV亞家族為柑橘所特有，且只含有1個Rboh成員（CsRboh07），表明CsRboh07是進化過程形成的柑橘特有的酶，可能具有特殊功能。

表3 CsRboh的二級結(jié)構(gòu)Table 3 The secondary structure of CsRbohs

圖1 多物種Rboh家族系統(tǒng)進化樹Fig. 1 The phylogenetic tree of Rboh family in several organisms

2.3 CsRboh家族染色體定位和基因結(jié)構(gòu)

對CsRboh在染色體上的定位進行分析和展示，發(fā)現(xiàn)CsRboh不均勻地分布于柑橘的5條染色體上（圖2），其中，CsRboh03定位于3號染色體，CsRboh04位于4號染色體，CsRboh01和CsRboh07定位于5號染色體，CsRboh05位于 7號染色體，CsRboh02和CsRboh06定位于8號染色體。為更好地了解CsRboh的結(jié)構(gòu)特點，利用 GSDS[43]對 CsRboh的基因結(jié)構(gòu)進行了分析和展示（圖2），發(fā)現(xiàn)7個基因均含11—13個外顯子；結(jié)合系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)相同亞家族基因具有相似基因結(jié)構(gòu)，但內(nèi)含子并非完全一致，其長度上有較大變異；柑橘Rboh家族第I亞家族中的基因均含11個外顯子，CsRboh03與CsRboh02、CsRboh05相比，基因的內(nèi)含子長度變異較大；第II亞家族中的基因具有12個外顯子；第III亞家族中CsRboh06有12個外顯子；第IV亞家族中的CsRboh07有13個外顯子；III和IV亞家族中兩個基因均無UTR區(qū)域。

2.4 CsRboh家族多序列比對及功能結(jié)構(gòu)域

利用Pfam對7個CsRboh進行功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明CsRboh家族成員均含有典型的4個功能結(jié)構(gòu)域，從N端起分別為呼吸爆發(fā)NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)域（respiratory burst NADPH oxidase，NADPH_Ox，PF08414.10）、鐵還原酶跨膜組件（ferric reductase like transmembrane component，F(xiàn)erric_reduct，PF01794.19）、FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（FAD-binding domain，F(xiàn)AD_binding，PF08022.12）和鐵還原酶 NAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ferric reductase NAD binding domain， NAD_binding，PF08030.12）（圖3-A）。蛋白序列的比對發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)域為207—308號氨基酸、鐵還原酶跨膜組件為514—677號氨基酸、FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域為720—851號氨基酸、鐵還原酶NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域為856—1 070號氨基酸，這些結(jié)構(gòu)域高度保守（圖3-B）。

2.5 CsRboh家族保守基序分析

利用MEME對CsRboh家族保守基序進行預(yù)測，得到15個相關(guān)性最高的保守元件（圖4-A），并整合基序的 Logo（圖 4-B）。CsRboh01、CsRboh03和CsRboh04均包含 15個保守基序，CsRboh05和CsRboh06包含14個，CsRboh02、CsRboh07包含12個；除CsRboh02沒有 Motif 5、Motif 9、Motif 10，其他 6 個成員均含有；Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 6、Motif 8、Motif 12 和 Motif 13 共 7 個保守基序為 7個CsRboh共有，且分布幾乎一致；結(jié)合Pfam分析的功能結(jié)構(gòu)域（圖3），發(fā)現(xiàn)這7個共有基序?qū)?yīng)CsRboh的功能結(jié)構(gòu)域。

圖2 CsRboh家族的染色體定位和基因結(jié)構(gòu)Fig. 2 The chromosomal loci and gene structures of CsRbohs

圖3 CsRboh家族的功能結(jié)構(gòu)域Fig. 3 The functional domains of CsRbohs

圖4 CsRboh家族蛋白保守基序Fig. 4 Conserved protein motifs in CsRboh family

2.6 CsRboh家族啟動子順式作用元件分析

為深入了解 CsRboh家族基因?qū)δ婢承盘柕拿{迫機制以及基因的誘導(dǎo)表達模式，對柑橘 Rboh的核心啟動子順式作用元件進行分析，發(fā)現(xiàn)植物抗病信號有關(guān)的 3種植物激素響應(yīng)元件茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）和水楊酸響應(yīng)元件（TCA-element）在7個基因中呈現(xiàn)不均勻分布（表4）。除CsRboh05外，其余6個基因啟動子均含有茉莉酸響應(yīng)元件，數(shù)量在1—3個。水楊酸響應(yīng)元件在該基因家族中較少，僅在CsRboh01、CsRboh02、CsRboh06中各包含1個。除CsRboh07外，其余基因均包含1—7個脫落酸響應(yīng)元件。

表4 CsRboh上游2 kb順式作用元件分布Table 4 Putative cis-acting elements existed in the 2 kb upstream region of CsRbohs

2.7 植物激素誘導(dǎo)下CsRboh表達模式

在晚錦橙和四季橘葉片中，7個CsRboh表達均受脫落酸、茉莉酸和水楊酸誘導(dǎo)，但其誘導(dǎo)模式存在差異（圖5—圖7）。

脫落酸誘導(dǎo)時，CsRboh03、CsRboh04、CsRboh07在兩個品種中誘導(dǎo)表達模式不同。晚錦橙中，CsRboh03在0—36 h內(nèi)表達量先上升，后急劇下降；四季橘中，0—12 h內(nèi)上調(diào)表達，12—36 h表達量下降，之后上升至最高水平。CsRboh04在兩個品種中表達模式類似，0—24 h表達量逐步下降，之后上升。兩個品種中CsRboh07也對脫落酸有明顯響應(yīng)，晚錦橙中，0—12 h內(nèi)上調(diào)表達，后期呈下降、上升、下降的趨勢；四季橘中則是在處理前24 h一直上調(diào)表達，之后表達量下降。其他基因雖響應(yīng)脫落酸誘導(dǎo)，但效果并不明顯（圖5）。

茉莉酸誘導(dǎo)時，CsRboh01、CsRboh03、CsRboh05、CsRboh06和CsRboh07在四季橘中表達均先上升后下降，36 h達到最高，而在晚錦橙中CsRboh03和CsRboh07表達模式相似，CsRboh01、CsRboh05和CsRboh06無明顯誘導(dǎo)。CsRboh02受茉莉酸誘導(dǎo)表達模式相反，晚錦橙中CsRboh02表達量先下降再上升，四季橘中CsRboh02表達量則先上升后下降（圖6）。

圖5 脫落酸誘導(dǎo)下CsRboh的相對表達量Fig. 5 The relative expression of CsRbohs induced by ABA

圖6 茉莉酸誘導(dǎo)下CsRboh的相對表達量Fig. 6 The relative expression of CsRbohs induced by JA

水楊酸誘導(dǎo)時，晚錦橙中CsRboh01、CsRboh04、CsRboh05和CsRboh06表達量總體呈先升后降趨勢，四季橘中這4個基因受水楊酸誘導(dǎo)不明顯；CsRboh02、CsRboh03和CsRboh07在兩個品種中受水楊酸誘導(dǎo)趨勢相似（圖7）。

2.8 柑橘潰瘍病菌誘導(dǎo)下CsRboh表達模式

潰瘍病菌侵染后，7個基因在兩個品種中均有不同程度的響應(yīng)（圖8）。晚錦橙中，CsRboh01、CsRboh04表達量變化總體呈現(xiàn)先升后降趨勢，CsRboh02、CsRboh06、CsRboh07表達量呈現(xiàn)出先升、后降、再升的趨勢，CsRboh03、CsRboh05表達量變化為先降、后升、再降的趨勢。四季橘中，CsRboh01、CsRboh05和CsRboh06表達呈現(xiàn)先降、后升、再降的趨勢，CsRboh05則在 36—48 h內(nèi)表達量再次升高。CsRboh03、CsRboh07表達量先升后降，CsRboh02、CsRboh04則是先升、后降、再升的趨勢，CsRboh04在最后一個時間段內(nèi)表達量出現(xiàn)下降。CsRboh02、CsRboh05和CsRboh07在兩個品種中具有相似誘導(dǎo)趨勢。除CsRboh07外，其他CsRboh表達量均在24 h達到最高。CsRboh04、CsRboh06在晚錦橙和四季橘兩個品種中誘導(dǎo)總體趨勢基本相反。

3 討論

植物體在應(yīng)對多種生物脅迫時產(chǎn)生大量的活性氧以對抗外界病原菌并激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而 Rboh可控制植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生來影響植物抗病性[47]。因此，越來越多的研究聚焦于Rboh的結(jié)構(gòu)和功能分析。Rboh在不同物種中基因家族數(shù)目不同，在水稻[30]、擬南芥[28]、小麥[48]和煙草[49]中Rboh家族分別有9、10、5和20個基因成員，而本試驗發(fā)現(xiàn)柑橘中有7個基因編碼CsRboh蛋白（CsRboh01-07）?；蚣易宕笮〉牟煌c家族中基因復(fù)制事件相關(guān)，在煙草中含有較多的復(fù)制事件，使該家族得以擴張[49]，而柑橘中并沒有基因復(fù)制。各物種中Rboh家族均包含4個功能結(jié)構(gòu)域，分別為呼吸爆發(fā)NADPH氧化酶結(jié)構(gòu)域、鐵還原酶跨膜組件、FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和鐵還原酶NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)在進化上高度保守，是植物 Rboh的顯著特征，也是發(fā)揮功能產(chǎn)生活性氧的前提。Rboh在不同物種中基因家族編碼產(chǎn)物大多位于細胞膜，擬南芥和柑橘中分別有8和5個基因編碼蛋白位于細胞膜，但葡萄中的一些 Rboh預(yù)測發(fā)現(xiàn)其位于葉綠體的類囊體膜上[50]，這類酶亞細胞定位的多樣性可能與該酶參與不同的脅迫應(yīng)答有關(guān)。

圖7 水楊酸誘導(dǎo)下CsRboh的相對表達量Fig. 7 The relative expression of CsRbohs induced by SA

圖8 柑橘潰瘍病菌侵染誘導(dǎo)CsRboh的相對表達量Fig. 8 The relative expression of CsRbohs induced by Xcc infection

有研究發(fā)現(xiàn)將水楊酸噴施到擬南芥上，不僅誘導(dǎo)病原相關(guān)蛋白（PR）基因的上調(diào)表達，而且能獲得系統(tǒng)性抗性，從而使植物對病原菌的抵抗能力普遍增強[51]。植物激素與植物抗病密切相關(guān)，但不同激素的信號途徑交叉，有時相互拮抗[52]。本研究檢測了 7個CsRboh在3種與生物脅迫應(yīng)答相關(guān)的植物激素和潰瘍病菌誘導(dǎo)下的表達情況，證實了某些成員在不同激素和潰瘍病菌誘導(dǎo)下的表達模式，供試 qRT-PCR引物根據(jù) Rboh家族基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計，確保兩個品種 qRT-PCR結(jié)果可以真實反映 CsRboh在潰瘍病抗、感品種中的表達模式。其中，CsRboh02均可響應(yīng)柑橘潰瘍病菌及3種植物激素的誘導(dǎo)。順式作用調(diào)控元件常在應(yīng)激條件下對基因轉(zhuǎn)錄進行關(guān)鍵的分子調(diào)控[53]，CsRboh02響應(yīng)激素誘導(dǎo)可能與其啟動子元件中含有茉莉酸響應(yīng)元件CGTCA-motif、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE有關(guān)，推測CsRboh02可能由于啟動子區(qū)域含有激素響應(yīng)元件響應(yīng)脫落酸、茉莉酸和水楊酸，通過調(diào)節(jié)激素變化響應(yīng)潰瘍病菌誘導(dǎo)從而參與柑橘抗病過程。通過蛋白質(zhì)序列比對發(fā)現(xiàn)CsRboh02與擬南芥AtRbohD、煙草NbRbohD具有較高同源性。AtRbohD可參與病原體誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生和寡半乳糖苷誘導(dǎo)的植物免疫，從而抵御外界病原菌侵染[54]。另外，AtRbohD在活性氧依賴的脫落酸信號傳導(dǎo)中起著重要作用，并參與植物防御反應(yīng)期間活性氧中間體的積累[55]。YOSHIOKA等[18]研究表明NbRbohD、NbRbohA和NbRbohB也直接參與對真菌病原的抗性。CsRboh02在其他物種中的同源基因多與植物抗病性相關(guān)，且本研究發(fā)現(xiàn)CsRboh02在柑橘潰瘍病菌誘導(dǎo)下表達水平明顯高于家族其他基因，在潰瘍病菌侵染的前24 h內(nèi)，在抗病品種四季橘中CsRboh02上調(diào)表達，表明該基因參與柑橘的基礎(chǔ)免疫。不過，CsRboh02表達量增長幅度高于晚錦橙，可能在抗病品種中經(jīng)潰瘍病菌誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的H2O2，從而激活植物過敏反應(yīng)。綜上，該基因可能在柑橘抗?jié)儾“l(fā)生的早期發(fā)揮著關(guān)鍵的基礎(chǔ)免疫作用，可在后續(xù)對其功能進行深入研究。

潰瘍病菌侵染后，CsRboh04表達量在感病品種晚錦橙和抗病品種四季橘中明顯不同，在晚錦橙中CsRboh04表達量受潰瘍病菌誘導(dǎo)明顯，表達量明顯高于四季橘（圖 8）。且前期通過 CAP甜橙數(shù)據(jù)庫（http://citrus.hzau.edu.cn/orange/）對CsRboh04表達量預(yù)測時發(fā)現(xiàn)其在葉片中的表達量僅為0.3，其真實表達量較低，這與潰瘍病菌誘導(dǎo)后CsRboh04在四季橘中表達量較低的情況相一致。系統(tǒng)進化樹中聚類關(guān)系相近的基因之間可能具有類似的功能[56]，結(jié)合系統(tǒng)進化樹及其蛋白質(zhì)同源序列比對發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtRbohE為CsRboh04的同源基因，盡管尚未闡明AtRbohE的作用，但有研究表明，在生物脅迫期間，其啟動子區(qū)域中存在傷口反應(yīng)元件（W-box）[57]。W-box可與WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的成員相互作用，在生物脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[51]。大量研究證明 WRKY家族大部分基因都參與植物抗病反應(yīng)[58]。由此可推斷CsRboh04在柑橘中可能參與抗病。

本試驗中，潰瘍病菌誘導(dǎo)24 h內(nèi)，CsRboh06在感病品種晚錦橙中表達量逐漸上調(diào)，在抗病品種四季橘中逐漸下調(diào)，在抗、感品種中表達趨勢基本相反，且順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)該基因在啟動子區(qū)域均包含脫落酸、水楊酸、茉莉酸響應(yīng)元件，CsRboh06也受到相應(yīng)激素不同程度的誘導(dǎo)表達，推斷CsRboh06可能通過響應(yīng)植物激素信號代謝通路進一步參與植物抗病過程。系統(tǒng)進化樹聚類分析發(fā)現(xiàn)，AtRboh08（H）、AtRboh10（J）、PtRboh05、PtRboh08與CsRboh06同屬第3組。目前對楊樹中Rboh的功能研究相對較少，僅有部分研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中NADPH氧化酶RbohH和RbohJ在花粉中特異表達，共同參與植物花粉管的生長發(fā)育，是重要的花粉基因[59]。CsRboh06在抗、感品種中所表現(xiàn)出的完全不同的表達情況及其與植物抗病反應(yīng)的相關(guān)性均有必要在后續(xù)試驗中進行功能的深入挖掘，不僅可為其他物種中相關(guān)基因的功能研究提供參考，也能為柑橘抗?jié)儾》肿佑N抗病基因的篩選提供依據(jù)。相關(guān)研究表明，受柑橘潰瘍病菌誘導(dǎo)后基因的表達差異性可能與抗病過程相關(guān)，比如CsBZIP40[3]、CsXTH04[60]和CsAP2-09[6]等在抗、感品種中以相反模式響應(yīng)潰瘍病菌侵染的基因，經(jīng)功能驗證均與潰瘍病發(fā)生有緊密關(guān)系。綜合以上分析，推斷CsRboh02、CsRboh04、CsRboh06為有潛力的抗?jié)儾『蜻x基因。

4 結(jié)論

基于柑橘全基因組數(shù)據(jù)鑒定到7個Rboh基因；定位在柑橘5條染色體上，編碼蛋白均含有Rboh保守結(jié)構(gòu)域；CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感品種中受柑橘潰瘍病菌誘導(dǎo)表現(xiàn)出不同的表達模式，推測其可能與柑橘對潰瘍病抗性相關(guān)。