阮文慧，唐玉蓮，倪安妮，李根亮，李曙波，陸瑞群，黃海玲

（右江民族醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 百色533000）

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TM）是腫瘤的內(nèi)部生存環(huán)境，腫瘤前微環(huán)境（pretumor microenvironment，PTM）是健康生理微環(huán)境（physiological microenvironment，PM）到TM之間的過渡階段［1］。與健康組織相比，TM中出現(xiàn)了大量的異常表達(dá)基因［1-2］。外泌體能通過其攜帶的基因參與多種生理、病理過程，TM中的外泌體與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3-4］。然而，外泌體來源的RNA剪接基因（exosome-derived RNA-splicing genes，ERGs）在模型小鼠的肝細(xì)胞癌微環(huán)境中發(fā)生發(fā)展的具體生理途徑仍少有報(bào)道。

RNA剪接調(diào)控著細(xì)胞周期的進(jìn)展，并在癌癥和多種疾病中起著重要作用［5］。mRNA前體的選擇性剪接是一種基本的調(diào)控機(jī)制。經(jīng)過選擇性剪接可產(chǎn)生多個(gè)不同的mRNA轉(zhuǎn)錄本，生成不同甚至相反功能的蛋白質(zhì)異構(gòu)體［6］。真核細(xì)胞中最豐富的核糖體RNA與mRNA剪接位點(diǎn)上的序列互補(bǔ)，經(jīng)RNA剪接酶的識(shí)別，切割和剪接RNA。剪接體的磷酸化可能通過調(diào)節(jié)RNA剪接參與HCC（hepatocellular carcinoma，HCC）的轉(zhuǎn)移［7］。RNA聚合酶相關(guān)蛋白則能參與mRNA前體的選擇性剪接并誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡［8］?？梢奟NA剪接與癌癥息息相關(guān)。

為探究這一問題，本研究以PM作為對(duì)照，通過構(gòu)建肝癌模型小鼠，分別提取PM、PTM和TM三組樣本中的總RNA進(jìn)行RNA測(cè)序（RNA-seq）和生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建外泌體來源RNA剪接基因作為比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)與測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)，篩選差異表達(dá)的外泌體來源RNA剪接基因（ERDs）和分析ERDs的功能及異常表達(dá)的可能原因。研究結(jié)果從分子機(jī)制的角度，為HCC發(fā)生發(fā)展過程中外泌體來源RNA剪接基因參與HCC的病理機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)H22肝癌細(xì)胞系（購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司）經(jīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)增長(zhǎng)期，3 000 r·min-1離心、洗滌、稀釋至終濃度105個(gè)·mL-1時(shí)用于構(gòu)建肝癌模型小鼠。

1.2 肝癌模型小鼠的構(gòu)建及樣本獲取100只健康昆明小鼠（鼠齡7周左右，體重22～25 g）隨機(jī)分成兩組，即實(shí)驗(yàn)組小鼠和陰性對(duì)照組小鼠（PM組）。實(shí)驗(yàn)組小鼠（n=60）給予每只雙前腋下注射指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)的H22肝癌細(xì)胞系0.2 mL（隔天注射一次，重復(fù)3次），其余的小鼠（n=40）注射不含H22的生理鹽水同法注射作為對(duì)照，分別正常飼養(yǎng)4周后分三組樣品進(jìn)行收集，實(shí)驗(yàn)組小鼠中成瘤小鼠分別取瘤體和肝未癌變部分為肝癌模型小鼠的TM和PTM，對(duì)照組小鼠中取健康肝組織細(xì)胞作為健康小鼠的肝組織（PM）［1-2］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用符合國(guó)家及右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理有關(guān)章程，在實(shí)驗(yàn)實(shí)施時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全制度及相關(guān)規(guī)章。

1.3 RNA提取和測(cè)序各樣本內(nèi)提取總RNA（n=20），同組內(nèi)等量取各樣本總RNA混合成混合總RNA樣本［1-2］，提取方法按照本實(shí)驗(yàn)室之前的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行，并送公司測(cè)序。RNA質(zhì)量檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄、文庫(kù)構(gòu)建、RNA-seq等按常規(guī)程序完成［1］。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因分析以小鼠RNA基因組為背景對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、注釋和較正，統(tǒng)計(jì)分析各基因RPKF（Reads Per Kilo bases per Million reads）值的差異，同一基因不同樣本間的RPKF比值≥2或≤0.5，且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.05的 基 因 作 為 差 異 表 達(dá) 基 因（differentially expressed genes，DEGs）。

1.5 ERDs的篩選使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以（"exosome"or"exosomal"）and（"splicing"or"spliceosome"or"spliceosomal"）為檢索詞，在NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。將檢索結(jié)果通過DAVID在線轉(zhuǎn)換成Ensembl gene ID和Official gene symbol后，將轉(zhuǎn)換結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)中的DEGs進(jìn)行比較，篩選出樣本間差異表達(dá)的外泌體源RNA剪切基因（exosome-derived RNA-splicing related DEGs，ERDs）。

1.6 ERDs的功能分析利用DAVID 6.8在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov）對(duì)21個(gè)高表達(dá)的ERDs進(jìn)行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析，并對(duì)富集到的生物學(xué)程序（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分 子 功 能（molecular function，MF）和信號(hào)通路（KEGG pathway）等進(jìn)行功能注釋聚類（functional annotation clustering），其中以FDR≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 ERDs編碼蛋白的互作分析通過STRING 11.0版本數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）在線對(duì)ERDs編碼蛋白進(jìn)行Co-expression互作分析，以評(píng)價(jià)其在表達(dá)上的相關(guān)性及其中發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。

1.8 ERDs的AS和SNV/INDEl與基因表達(dá)的相關(guān)性分析用Excel 2010和SPSS統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)外泌體相關(guān)的ERDs中出現(xiàn)的AS（alternative splicing，AS）和單核苷酸位點(diǎn)變異（single nucleotide variants，SNV）及插入缺失標(biāo)記（insertion/deletion，INDEL）進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，其中P＜0.05且兩樣本間發(fā)生頻率的倍數(shù)不小于2的為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上。

1.9 RT-qPCR驗(yàn)證ERDs隨機(jī)選擇3個(gè)在三組樣本都表達(dá)的ERDs進(jìn)行RT-qPCR分析，以驗(yàn)證基因表達(dá)量和RNA-seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性，同一樣本間和同一組不同樣本間的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR條件參照文獻(xiàn)，引物采用在線引物設(shè)計(jì)軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工進(jìn)行合成［1-2］。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)內(nèi)參基因?yàn)?8sRNA。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)TM組、PTM組及PM組通過RNAseq分別獲得了5.01 G base（35.28 M clean reads）、5.06 G base（35.36 M clean reads）和5.02 G base（35.32 M clean reads）的數(shù)據(jù)。三組樣本所得clean reads對(duì)基因組的匹配率分別為92.65%、90.10%和89.20%，且三樣本測(cè)序數(shù)據(jù)的Q20皆大于99%。

2.2 ERDs NCBI的nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到28 275個(gè)與小鼠外泌體RNA以及RNA剪接相關(guān)的核苷酸序列。經(jīng)DAVID 6.8軟件共成功注釋到12 273個(gè)ERGs作為研究背景。在TM和PM之間總共有4 533個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)組差異表達(dá)基因（DEGs），與DEGs匹配的ERDs有151個(gè)，其中10個(gè)下調(diào)、141個(gè)上調(diào)。在TM和PTM之間總共有4 042個(gè)DEGs，篩選出的ERDs有169個(gè)，其中11下調(diào)、158個(gè)上調(diào)。兩組對(duì)比樣本中共有21個(gè)相同的ERDs都在TM中高表達(dá)。

2.3 ERDs的功能以上篩選出的21個(gè)相同的ERDs功能富集分析結(jié)果顯示，它們主要富集到4個(gè)BP、5個(gè)CC、2個(gè)MF和1個(gè)KEGG pathway（圖1）。它們主要參與剪接體的功能執(zhí)行，尤其是在剪接體執(zhí)行剪接過程中ploy（A）RNA結(jié)合、核來源的第二步剪接小體的催化作用以及mRNA前體的剪接和剪接體snRNP組裝。結(jié)果表明，它們可能通過剪接體調(diào)控的信號(hào)通路（圖2）促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。

圖1 ERDs的功能

圖2 ERDs參與剪接體的過程（紅星表示該基因在TM中表達(dá)上調(diào)）

2.4 ERDs編碼蛋白的相互作用21個(gè)上調(diào)的ERDs編碼蛋白的相互作用見圖3。

圖3 ERDs編碼蛋白的互作關(guān)系

2.5 ERDs的AS和SNV/INDEL 21個(gè)在TM中高表達(dá)的ERDs的AS分析結(jié)果顯示，Hnrnpa1和Lsm3兩個(gè)基因發(fā)生了AS，且其與這兩個(gè)基因一樣，在TM中都上調(diào)表達(dá)，而在PTM和PM中都下調(diào)表達(dá)?？梢?，AS的發(fā)生可能與相應(yīng)基因的表達(dá)呈正相關(guān)。

SNV和INDEL分析顯示，TM與PM對(duì)比，差異基因發(fā)生了110個(gè)SNV和3個(gè)INDEL位點(diǎn)的改變；TM與PTM對(duì)比，差異基因發(fā)生了112個(gè)SNV和4個(gè)INDEL位點(diǎn)的改變。且兩組對(duì)比樣本的基因位點(diǎn)的改變都主要發(fā)生在基因的6個(gè)部位，即外顯子區(qū)（exonic）、內(nèi)含子區(qū)（intronic）、基因間區(qū)（intergenic）、基因下游區(qū)（downstream）、基因上游區(qū)（upstream）和剪接區(qū)（splicing）（圖4）。在這些核苷酸位點(diǎn)發(fā)生改變的基因中，TM與PM對(duì)比中有16個(gè)RNA剪接相關(guān)的差異基因的SNV改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中有12個(gè)ERDs的SNV改變與其基因的表達(dá)呈正相關(guān)（表1）。TM與PTM中有16個(gè)差異基因SNV改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中11個(gè)SNV改變與其基因的表達(dá)也呈正相關(guān)（表2）。

在TM與PM對(duì)比中，11個(gè)ERDs在TM中出現(xiàn)了50個(gè)SNV現(xiàn)象，但在PM無此位點(diǎn)改變（表3）。在TM與PTM對(duì)比中，12個(gè)ERDs在TM中出現(xiàn)了40個(gè)SNV現(xiàn)象，但PTM中沒有出現(xiàn)這些位點(diǎn)改變（表4）。

圖4兩組對(duì)比樣本中ERDs的SNV和INDEL在基因不同部位上發(fā)生的頻率

表1 TM/PM中ERDs的SNV發(fā)生頻率與基因表達(dá)的相關(guān)性

表2 TM/PTM中ERDs的SNV發(fā)生頻率與基因表達(dá)的相關(guān)性

2.6 RT-qPCR結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示（n=3），隨機(jī)選擇的3個(gè)ERDs的表達(dá)結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致（圖5）。引物序列見表5。

表3 TM/PM中ERDs的SNV發(fā)生情況

表4 TM/PTM中ERDs的SNV發(fā)生情況

圖5 ERDs在TM/PTM以及TM/PM中的相對(duì)表達(dá)情況（與對(duì)照組相比）

表5 RT-qPCR引物

3 討論

在本研究中，我們通過從NCBI上找到RNA剪接有關(guān)基因和小鼠外泌體RNA基因構(gòu)建背景基因，利用背景基因與高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，篩選得到了21個(gè)在TM中高表達(dá)的外泌體源RNA剪接相關(guān)基因（ERGs）。這些差異基因包括：Fancd2、Ctnna1、Tnfrsf1b、DNAJB1、dis3、KIF23等，它們主要參與了催化作用的步驟2剪接小體、剪接體snRNP組裝等生物學(xué)過程，這些生物學(xué)過程可能通過poly（A）RNA結(jié)合的方式以剪接體通路來促進(jìn)HCC的發(fā)生發(fā)展。

真核細(xì)胞中剪接體執(zhí)行的過程是基因表達(dá)的重要環(huán)節(jié)，一些疾病的起因可由剪接體蛋白的突變而影響轉(zhuǎn)錄本的剪接，甚至一些癌癥也與剪接因子的錯(cuò)誤調(diào)控有關(guān)［9］。例如：婦科惡性疾病如宮頸癌，剪接因子對(duì)常見Fancd2基因結(jié)構(gòu)異常起重要作用，引起了復(fù)發(fā)患者中Fancd2基因突變率高，F(xiàn)ancd2基因突變形式通常為基因組的缺失，最終導(dǎo)致了Fancd2基因的低表達(dá)或功能缺失，導(dǎo)致宮頸癌預(yù)后不良易復(fù)發(fā)［10］；Hdm2剪接體與結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖相關(guān)，其通過下調(diào)抑癌基因表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展［11］；在t（8，21）急性髓系白血病中，選擇性剪切體AML1-ETO9a與細(xì)胞的惡性程度息息相關(guān)［12］；LSM剪接體蛋白過度表達(dá)導(dǎo)致肺癌細(xì)胞選擇性剪接增多［13］。在本研究結(jié)果中，LSM剪接體蛋白基因中的Lsm2和Lsm3，在HCC發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。Lsm2和Lsm3編碼蛋白位于細(xì)胞核中起催化作用的第二步剪接小體中，通過poly（A）RNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA前體剪接異常，不能成為成熟的mRNA。并且Lsm2和Lsm3編碼蛋白又與細(xì)胞內(nèi)的核糖核蛋白復(fù)合體密切相關(guān)，核糖體的異常導(dǎo)致mRNA無法通過核糖體的作用轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)行使生命活動(dòng)的各種功能。

另外，RNA-結(jié)構(gòu)元件在mRNA前體的剪接催化中起著關(guān)鍵作用，然而RNA催化結(jié)構(gòu)的形成需要剪接體蛋白的協(xié)助。Rbm22作為一種剪接體蛋白在促進(jìn)剪接體催化RNA元件活性構(gòu)象中的具有潛在作用［14］。而Snrpd1參與催化mRNA前體剪接、調(diào)節(jié)多功能特異性剪接體組裝及獲得和維持多潛能剪接，與許多免疫性疾病有關(guān)，如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡［15］。本研究中，催化作用的第二步剪接小體中的Rbm22和Snrpd1上調(diào)表達(dá)，使剪接體snRNP組裝異常，從而影響poly（A）RNA結(jié)合，并導(dǎo)致mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性降低，mRNA被過早降解。這些基因都來源細(xì)胞核，且相互關(guān)聯(lián)而影響剪接體通路。我們的研究中的通路圖和蛋白互作圖表明了這一點(diǎn)。

已知mRNA表達(dá)過程中的AS事件會(huì)產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)，并且這種情況也發(fā)生在肝癌的發(fā)展過程中［16］。我們的AS分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TM樣本中Hnrnpa1和Lsm3內(nèi)AS和基因表達(dá)均上調(diào)表達(dá)，也同樣證明了這一點(diǎn)?？梢?，引起基因多態(tài)性的遺傳因素AS與基因表達(dá)呈正相關(guān)。另外，SNV分析顯示SNV改變與RNA剪接基因表達(dá)量具有很強(qiáng)的相關(guān)性，TM中上調(diào)表達(dá)RNA剪接基因多具有SNV現(xiàn)象，但在PTM和PM中無此SNV現(xiàn)象；基因位點(diǎn)突變和選擇性剪接在健康組織和癌旁健康組織中并無發(fā)生，但在癌癥發(fā)生后，由于RNA剪接基因上的這些基因位點(diǎn)的突變導(dǎo)致剪接體出現(xiàn)變異。因此，RNA剪接基因中的AS以及SNV突變可能導(dǎo)致異常剪接和poly（A）RNA異常結(jié)合，在HCC發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上所述，在肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程中，在TM樣本中上調(diào)表達(dá)21個(gè)ERGs影響了參與poly（A）RNA結(jié)合的Lsm2、Magoh、Eftud2、Rbm22等因子，導(dǎo)致剪接體通路出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和mRNA的翻譯效率受到影響。其中Pabpc1、Ppil1、Lsm2等還出現(xiàn)異常上調(diào)表達(dá)，使核中步驟2剪接小體異常催化；Snrpd1、Smn1、Gemin5和Rbm22等異常上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致剪接體snRNP組裝出現(xiàn)異常，這造成附加因子和剪接裝置的錯(cuò)誤剪接而參與HCC的發(fā)生發(fā)展，且這種異常剪接與ERDs自身的基因多態(tài)性改變有關(guān)。