武鵬鵬，王雅學(xué)，沈洪艷,*

1. 河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018 2. 河北省藥用分子化學(xué)重點實驗室，石家莊 050018

四環(huán)素類抗生素是目前使用量最大的一類人畜共用藥物，每年用量占中國抗生素使用總量的14%左右[1-2]。四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，被大量用于促進(jìn)動物生長的促進(jìn)劑及人和動物的感染性疾病的治療[3-5]。土霉素是其中使用量最大的一種，被添加到家畜飼料中預(yù)防疾病和促進(jìn)家畜生長。抗生素類藥物在動物體內(nèi)很難吸收，30%～90%通過動物尿便以母體或代謝產(chǎn)物的形態(tài)排出體外后進(jìn)入環(huán)境中[6]。由于四環(huán)素類抗生素過量使用，在環(huán)境中出現(xiàn)了“假持久性”現(xiàn)象，并引起了一系列的生態(tài)環(huán)境污染問題[7]。Kümmerer[8]發(fā)現(xiàn)人或動物體排出的大量抗生素通過各種途徑最終進(jìn)入水環(huán)境，并對水生生物造成危害[9]。有研究表明，美國地表水中土霉素檢出濃度為340 ng·L-1[10]，巴西水產(chǎn)水域中土霉素檢出濃度為14～7 993 ng·L-1 [11]，我國水體中抗生素檢出濃度已達(dá)到μg級甚至mg級[12-13]，安徽汪洋河水體中土霉素檢出濃度為3.6×105ng·L-1[14]。

很多學(xué)者研究了土霉素的毒性效應(yīng)，土霉素對魚腥藻和銅綠微囊藻的生長繁殖具有一定的抑制作用，6～90 mg·L-1的土霉素對銅綠微囊藻的葉綠素a表現(xiàn)為抑制作用，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)[15-16]。趙素芬和曹日波[17]研究了不同濃度土霉素對湛江等鞭金藻的細(xì)胞數(shù)量、葉綠素含量和類胡蘿卜素含量的影響，發(fā)現(xiàn)0～10 mg·L-1的土霉素隨著濃度的增加，金藻的細(xì)胞數(shù)量在生長期增幅越小，在衰退期衰退越快，且葉綠素a含量越少，而類胡蘿卜素含量增加。田智宇等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)土霉素廢渣中含量為25～50 mg·kg-1時，對黃瓜種子發(fā)芽和幼苗生長有促進(jìn)作用，超過100 mg·kg-1對黃瓜種子和幼苗表現(xiàn)出顯著性抑制作用。土霉素廢水對斑馬魚會造成氧化損傷，并進(jìn)一步損傷DNA[19-20]。斑馬魚暴露于青土霉素廢水時，斑馬魚超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)發(fā)生了顯著性變化，在第8天斑馬魚受到了明顯的氧化損傷[21]。因此，土霉素的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)需進(jìn)一步關(guān)注。

單細(xì)胞藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)食物鏈的起點，對整個生態(tài)系統(tǒng)影響較大，并且具有易獲得、繁殖快和對環(huán)境敏感等特點，被廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)試驗，其中，斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)是國際化標(biāo)準(zhǔn)組織(ISO)認(rèn)可的試驗?zāi)Ｊ缴镏?，也是我國環(huán)境監(jiān)測試驗藻種[22]，所以，學(xué)者們把斜生柵藻應(yīng)用于對抗生素毒理學(xué)研究中，通過暴露實驗，從斜生柵藻的生化指標(biāo)變化情況來衡量抗生素的毒性效應(yīng)。

本研究，以土霉素為試驗對象，以斜生柵藻為模式生物，通過研究土霉素對斜生柵藻生長抑制以及對葉綠素a含量、SOD活性、MDA含量和活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量的影響，來探究土霉素對斜生柵藻的毒性效應(yīng)機(jī)制，為評估土霉素對藻類的環(huán)境風(fēng)險提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

土霉素(oxytetracycline dihydrate)購買自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS6153-64-6，純度為97%，分子式為C22H24N2O9·H2O。

取適量土霉素，溶解在BG-11培養(yǎng)基中，攪拌使其充分溶解以獲得1 g·L-1的母液，用倍數(shù)稀釋法稀釋母液以獲得土霉素工作溶液(0、2、4、10、20和40 mg·L-1)備用。

本實驗選用的斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)株系購買自中國科學(xué)院淡水藻種庫，編號FACHB-12。實驗期間嚴(yán)格按照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)發(fā)布的OECD 201藻類生長抑制實驗方法中的暴露實驗質(zhì)量控制措施進(jìn)行，要求實驗進(jìn)行無菌操作，將斜生柵藻培養(yǎng)在人工氣候培養(yǎng)箱(PRX-250B，寧波賽福實驗儀器有限公司，中國)中，溫度(25±1) ℃，濕度60%，光照強(qiáng)度為12 000 LX，光照周期為14 h晝∶10 h夜，每天人工搖蕩至少3次，多次反復(fù)接種，使其處于對數(shù)生長期。

1.2 實驗方法

在無菌條件下，按照OECD 201藻類生長抑制實驗方法，選取生長狀態(tài)良好的斜生柵藻進(jìn)行實驗，初始藻液濃度為1×106個·mL-1，實驗溶液由藻液和土霉素工作溶液配制(V藻液∶V工作溶液=1∶1)，最終實驗溶液濃度為0、1、2、5、10和20 mg·L-1，每個濃度設(shè)3個平行組。

1.2.1 藻細(xì)胞生長量的測定

本實驗建立了斜生柵藻細(xì)胞密度與吸光度之間的線性方程，擬合優(yōu)度R2>0.99，將藻細(xì)胞暴露在不同濃度的土霉素中96 h，每24小時測定各濃度組在685 nm處的吸光度，進(jìn)而獲得藻密度。

1.2.2 葉綠素a含量的測定

各濃度組取5 mL藻液，6 000 r·min-1離心15 min，并用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.01 mol·L-1，pH=7.3)清洗3次，去除上清液，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇在75 ℃水浴鍋中水浴3 min。再次離心后用紫外分光光度計測定在665 nm和649 nm處吸光度，并依據(jù)公式進(jìn)行計算[23]：

ca=13.95A665-6.88A649

1.2.3 粗酶液的提取

各濃度組取10 mL藻液，6 500 r·min-1離心15 min，用預(yù)冷的PBS清洗3次，用10 mL PBS再次懸浮藻細(xì)胞，在冰水浴下用超聲波細(xì)胞破碎儀(BILON92-IIDL，上海比朗儀器制造有限公司，中國)破碎10 min，設(shè)置功率95%，工作8 s，間隔3 s，細(xì)胞破碎后，在4 ℃下以10 000 r·min-1離心10 min，上清液為粗酶液。

1.2.4 ROS、SOD和MDA的測定

ROS采用DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)活性氧探針，用多功能酶標(biāo)儀(Synergy H1，美國伯騰儀器有限公司)在激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長525 nm下測定；SOD采用黃嘌呤氧化酶法[24]測定；MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法[25]測定；以上測定均嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示。用SPSS 24對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way Anova)，并進(jìn)行顯著性差異分析及t檢驗，P<0.05，表示差異顯著，使用Origin 2017繪圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 土霉素對斜生柵藻生長的影響

通過血球計數(shù)板計數(shù)得斜生柵藻細(xì)胞濃度(y)與其在685 nm下測得的吸光度(x)的線性回歸方程為y= 78.398x-9.257(R2= 0.9956)。用不同濃度的土霉素分別處理藻液，以藻細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，暴露時間為橫坐標(biāo)繪制生長曲線，如圖1所示。

圖1 土霉素對斜生柵藻生長的影響Fig. 1 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the growth of Scenedesmus obliquus

由圖1可知，在所測濃度范圍的土霉素的脅迫下，各濃度組斜生柵藻生長均受到抑制作用，并且隨著時間的延長，生長抑制越明顯；斜生柵藻在96 h生長抑制最為嚴(yán)重，1、2、5、10和20 mg·L-1的土霉素對斜生柵藻的抑制率分別達(dá)到了15.5%、17.8%、25.8%、25.7%和44.4%。經(jīng)SPSS軟件計算可知，土霉素對斜生柵藻96 h半數(shù)效應(yīng)濃度(96 h-EC50)為21.3 mg·L-1，無可見效應(yīng)濃度(NOEC)為2 mg·L-1，最低可觀察效應(yīng)濃度(LOEC)為5 mg·L-1。

2.2 土霉素對斜生柵藻葉綠素a含量的影響

葉綠素a是植物進(jìn)行光合作用的重要參數(shù)之一，植物通過光合作用產(chǎn)生自身需要的能量和有機(jī)物，其濃度變化能夠直接影響植物生物量的變化，并且可以間接反映植物生長繁殖情況[26]。圖2為土霉素對斜生柵藻葉綠素a含量的影響，由圖2可知，土霉素對斜生柵藻葉綠素a含量的影響與其對斜生柵藻生長的影響呈現(xiàn)相似的變化規(guī)律，96 h內(nèi)，隨時間延長，各濃度組葉綠素a含量均有增長，但隨暴露濃度的增加，葉綠素a受到的抑制作用也越來越明顯，表現(xiàn)出了一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。24 h時，各濃度組與對照組相比，葉綠素a含量無明顯差異；72 h時，1 mg·L-1和2 mg·L-1濃度組表現(xiàn)出了短暫的促進(jìn)作用；在96 h時，2 mg·L-1濃度組與對照組相比表現(xiàn)出了顯著性差異(P<0.01)，5、10和20 mg·L-1濃度組表現(xiàn)出了顯著抑制(P<0.001)，葉綠素a含量分別下降了24.2%、21.7%和28.9%。

2.3 土霉素對斜生柵藻SOD活性的影響

SOD屬于金屬酶，是唯一以自由基為底物的抗氧化酶，在清除過量活性氧自由基、控制膜脂質(zhì)過氧化水平及減輕膜氧化損傷過程中，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[27-28]。土霉素對斜生柵藻SOD活性的影響如圖3所示，各濃度組斜生柵藻SOD活性與對照組相比，除1 mg·L-1濃度組略微升高外，其他濃度組均表現(xiàn)為抑制作用；1 mg·L-1濃度組達(dá)到實驗期間最大值675.96 U·mg-1prot，2、10和20 mg·L-1濃度組實驗期間受到顯著抑制(P<0.05)，20 mg·L-1濃度組達(dá)到最低值，比對照組低38.8%。這可能是由于10 mg·L-1和20 mg·L-1的土霉素對斜生柵藻造成了嚴(yán)重的氧化損傷，并且抑制了SOD酶的合成。

圖3 土霉素對斜生柵藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：字母相同表示不同濃度組間差異不顯著，字母不同表示不同濃度組間差異顯著；下同。Fig. 3 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the superoxide dismutase (SOD) activity of Scenedesmus obliquusNote: The same letters indicate no significant difference among different concentration groups; different letters indicate significant differences among different concentration groups; the same below.

2.4 土霉素對斜生柵藻MDA含量的影響

MDA是自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, P-UFA)發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用形成的脂質(zhì)過氧化物[29]；它可與生物膜上的蛋白質(zhì)氨基酸殘基或核酸反應(yīng)生成席夫堿，降低生物膜的穩(wěn)定性[30-32]。MDA含量可以反映出膜脂的過氧化程度，也是反映生物氧化損傷的代表性指標(biāo)[33]。土霉素對斜生柵藻MDA含量的影響如圖4所示。MDA含量隨著土霉素濃度的增加呈現(xiàn)出上升的趨勢；1 mg·L-1和2 mg·L-1濃度組與對照組相比MDA含量無顯著性差異，這表明斜生柵藻的抗氧化系統(tǒng)能夠清除該濃度下土霉素的氧化脅迫；5、10和20 mg·L-1濃度組與對照組相比MDA含量受到了顯著性誘導(dǎo)(P<0.05)，MDA含量分別為對照組的1.5倍、2.2倍和3.2倍，表明斜生柵藻細(xì)胞已經(jīng)受到了一定程度的氧化損傷。

圖4 土霉素對斜生柵藻丙二醛(MDA)含量的影響Fig. 4 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the malondialdehyde (MDA) content of Scenedesmus obliquus

2.5 土霉素對斜生柵藻ROS的影響

ROS是分子氧在還原過程中的一系列中間產(chǎn)物，其生成和清除在正常生命過程中維持著動態(tài)平衡，細(xì)胞內(nèi)的ROS被控制在很低水平，在抗菌消炎方面起著重要作用[34]。但當(dāng)外源污染物入侵時，ROS生成快速增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，造成細(xì)胞氧化損傷[35]。土霉素對斜生柵藻ROS的影響如圖5所示。1 mg·L-1和2 mg·L-1濃度組與對照組相比ROS無顯著性變化(P>0.05)，表明細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶大量合成，抵消了大部分過量的ROS；5 mg·L-1濃度組與對照組相比ROS受到顯著抑制(P<0.05)，可能是由于藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶為抵消氧化應(yīng)激，過量消耗了ROS；10 mg·L-1濃度組與對照組相比無顯著性差異，但ROS水平略微偏高；20 mg·L-1濃度組與對照組相比ROS受到顯著性誘導(dǎo)(P<0.01)，ROS水平為對照組的1.2倍，表明土霉素在藻細(xì)胞膜內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS，并對藻細(xì)胞造成氧化損傷，藻細(xì)胞無法合成足夠的抗氧化酶來清除過量ROS。

圖5 土霉素對斜生柵藻活性氧(ROS)的影響Fig. 5 Effects of oxytetracycline hydrochloride on the reactive oxygen species (ROS) of Scenedesmus obliquus

3 討論(Discussion)

在本實驗中，不同濃度的土霉素暴露對斜生柵藻表現(xiàn)出了一定的“劑量-效應(yīng)”和“時間-效應(yīng)”關(guān)系。本實驗所設(shè)定土霉素濃度對斜生柵藻均表現(xiàn)出抑制作用，并且隨著時間的延長，土霉素對斜生柵藻的抑制作用越明顯，余彬彬等[36]將玉米幼苗暴露于土霉素時發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象，各濃度組中土霉素對玉米幼苗總根長均表現(xiàn)為抑制作用；劉永濤等[37]用不同濃度的強(qiáng)力霉素處理斜生柵藻時發(fā)現(xiàn)，在2 mg·L-1濃度組表現(xiàn)為促進(jìn)作用，高于2 mg·L-1濃度組表現(xiàn)為抑制作用，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)抗生素具有“Hormesis”現(xiàn)象[38]，本研究未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象可能是因為土霉素毒性比強(qiáng)力霉素強(qiáng)，只有當(dāng)土霉素濃度非常低時才會出現(xiàn)“促進(jìn)”現(xiàn)象發(fā)生。本實驗結(jié)果表明，隨著土霉素濃度的增加，斜生柵藻受到的生長抑制作用越明顯，20 mg·L-1土霉素表現(xiàn)為顯著性抑制，張迪等[7]研究金霉素及其異構(gòu)體降解產(chǎn)物對斜生柵藻毒性時，也發(fā)現(xiàn)了明顯的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，抗生素對細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有一定的破壞能力[39-40]，可能土霉素濃度越高對斜生柵藻細(xì)胞壁和細(xì)胞膜會造成更大的損傷。已有報道顯示，土霉素對銅綠微囊藻的96 h-EC50為7.2 mg·L-1 [41]，對小麥種子的EC50為54.2 mg·L-1 [42]，本研究中土霉素對斜生柵藻96 h-EC50為21.3 mg·L-1。

葉綠素a是葉綠素中的重要組成部分，葉綠素a的含量可以直接反映藻細(xì)胞的光合作用效率，并且與藻細(xì)胞量呈正相關(guān)[43]。吳妹英[16]在研究土霉素對銅綠微囊藻繁殖的影響時發(fā)現(xiàn)，銅綠微囊藻的葉綠素a含量與生長量變化一致。鮑潔等[44]研究鹽酸恩諾沙星對斜生柵藻的影響時，也發(fā)現(xiàn)葉綠素a含量與生物量有相同的關(guān)系，且葉綠素a在污染物脅迫下受到抑制作用。本研究得到了相似的結(jié)果，斜生柵藻在土霉素的脅迫下，葉綠素a受到了明顯的抑制作用，對比生長曲線可知，葉綠素a含量與藻細(xì)胞濃度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系；這可能是由于土霉素?fù)p害了藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及胞內(nèi)葉綠體等細(xì)胞器，從而影響了光合色素的合成，斜生柵藻光合作用降低，從而抑制藻細(xì)胞繁殖[45]。

圖6為機(jī)體氧化指標(biāo)關(guān)系圖，正常機(jī)體內(nèi)自由基的代謝處于動態(tài)平衡狀態(tài)[46]，但當(dāng)受到污染物入侵時，機(jī)體內(nèi)ROS會大量生成，SOD是避免機(jī)體受到氧化損傷的第一道防線，SOD可以催化氧自由基反應(yīng)生成H2O2和O2[47]，之后再經(jīng)過其他抗氧化酶作用進(jìn)一步消除，當(dāng)機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)無法清除過量ROS時，就會造成機(jī)體的氧化損傷，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成MDA。本研究中，斜生柵藻在土霉素的脅迫下，ROS水平隨著濃度增加而升高，藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)無法完全清除高濃度土霉素(10 mg·L-1和20 mg·L-1)脅迫下機(jī)體產(chǎn)生的自由基，造成SOD活性降低，這也可能是藻細(xì)胞受到氧化損傷導(dǎo)致無法正常合成SOD；因此，過量的ROS造成了斜生柵藻MDA含量的升高；張迪等[7]研究金霉素對斜生柵藻的影響時發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，并得出SOD與ROS呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，沈洪艷等[48-49]分別用諾氟沙星和環(huán)丙沙星處理錦鯉，也同樣發(fā)現(xiàn)了隨著暴露濃度的升高，SOD活性受到了抑制，而隨著暴露濃度的升高，MDA受到了誘導(dǎo)作用。喻燚等[50]研究4-壬基酚對擬柱胞藻影響時，發(fā)現(xiàn)SOD活性變化規(guī)律與本研究相反，這可能是由于4-壬基酚對擬柱胞藻毒性較小，未造成胞內(nèi)損傷，為應(yīng)對氧化應(yīng)激，促進(jìn)了藻細(xì)胞合成SOD。

綜上所述，土霉素對斜生柵藻生長及光合作用水平具有明顯抑制作用；10 mg·L-1和20 mg·L-1土霉素造成藻細(xì)胞ROS水平升高，大量消耗SOD，且造成了細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致SOD合成受阻，從而活性降低，過量ROS也造成了細(xì)胞生物膜的膜脂質(zhì)過氧化，使得MDA含量升高。因此，10 mg·L-1和20 mg·L-1土霉素會對斜生柵藻造成氧化損傷，具體致毒機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

圖6 氧化指標(biāo)關(guān)系圖Fig. 6 Relationship diagram of oxidation index

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