馮棟梁，封林玉，張倚劍，梁天柱，梁明振

廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004

獸藥抗生素的使用大大降低了畜禽感染疾病的死亡率。隨著畜禽的集約化養(yǎng)殖，抗生素的大量甚至過(guò)量且持續(xù)的使用，導(dǎo)致致病性細(xì)菌的抗藥性也在穩(wěn)步增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)抗生素使用量16.2萬(wàn)t，獸用抗生素占52%[1]。其中，四環(huán)素類(lèi)抗生素(TCs)的用量占所有抗生素飼料添加劑的57%[2-3]。有資料顯示，2018年我國(guó)生豬養(yǎng)殖量占世界生豬總養(yǎng)殖量的56.6%，遠(yuǎn)高于美國(guó)等國(guó)家以及歐盟。豬糞在畜禽糞污排放量中所占比例最大，占畜禽糞便總量的36.71%[4]。整體而言，國(guó)內(nèi)外豬糞中抗生素殘留量呈現(xiàn)以下規(guī)律：四環(huán)素類(lèi)>氟喹諾酮類(lèi)>磺胺類(lèi)>大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)[5]。TCs是從鏈霉菌培養(yǎng)液中提取或半合成的一類(lèi)抗生素，常見(jiàn)的有金霉素(chlortetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)、四環(huán)素(tetracycline, TC)和多西環(huán)素(doxycycline, DXC)等。它們?cè)谪i體內(nèi)不能被完全吸收，一部分在豬組織內(nèi)累積殘留；另一部分隨豬糞排出體外。據(jù)報(bào)道，TCs能通過(guò)吸附、遷移和降解在土壤、水、植物和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，使TCs抗性基因在自然環(huán)境中呈不同程度的分布[6]。

另外，長(zhǎng)時(shí)間大量使用TCs，不僅使豬腸道產(chǎn)生耐藥細(xì)菌，豬糞中抗生素抗性基因(antibiotic resistance gene, ARGs)增加，還使豬組織中TCs殘留，給生態(tài)平衡和人類(lèi)健康構(gòu)成威脅[7-11]。近年來(lái)，豬糞中抗生素的轉(zhuǎn)歸、降解及生態(tài)學(xué)效應(yīng)日益受到關(guān)注。加快豬糞無(wú)害化處理和資源化利用，推進(jìn)豬糞提質(zhì)增效在農(nóng)業(yè)生態(tài)領(lǐng)域已成為一個(gè)重要的研究課題。因此，筆者就豬糞堆肥過(guò)程中堆體環(huán)境控制、TCs生物轉(zhuǎn)化過(guò)程、微生物群落動(dòng)態(tài)變化和ARGs控制等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為豬糞中TCs的降解及豬糞無(wú)害化還田提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 豬糞中TCs的分布現(xiàn)狀及堆肥中理化參數(shù)調(diào)控(Distribution status of TCs in pig manure and regulation of physical and chemical parameters in compost)

1.1 豬糞中TCs的分布現(xiàn)狀

自20世紀(jì)50年代美國(guó)食品與藥物管理局(FAD)將抗生素用作飼料添加劑以來(lái)，在降低動(dòng)物特別是幼齡畜禽死亡率方面成效顯著，因此，抗生素在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域得到迅速推廣[12]。大部分抗生素屬于廣譜抗菌藥物，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致ARGs在一個(gè)更大范圍內(nèi)轉(zhuǎn)移和傳播[13-14]。最新研究表明，人類(lèi)自身對(duì)抗生素的不恰當(dāng)使用比率為25%，而在動(dòng)物中此比率則高達(dá)50%。TCs作為一種被大量使用的抗生素，當(dāng)前環(huán)境中的污染源主要來(lái)自畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)糞污的排放、農(nóng)藥和醫(yī)院及藥廠廢棄物的處理[15]，而農(nóng)業(yè)土壤中TCs的分布主要源自畜禽糞便的施用[16]。

TCs其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于氫化并四苯的衍生物，有4個(gè)環(huán)組成，屬于酸堿兩性化合物。其中，TC和OTC都是極性分子，有多種官能團(tuán)。它們?cè)谪i體內(nèi)吸收率低，在環(huán)境中能以不同方式與多種介質(zhì)發(fā)生吸附作用，從而不易被降解[17-19]。常見(jiàn)的TCs分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。TCs在豬體內(nèi)經(jīng)代謝后胃腸道吸收很少，少部分以無(wú)活性產(chǎn)物、大部分以母體的形式排出體外，新鮮豬糞中TCs含量高達(dá)69%～86%[20-21]。這些隨豬糞排泄進(jìn)入環(huán)境的TCs，對(duì)自然環(huán)境和生物安全具有潛在安全隱患。我國(guó)不同地區(qū)豬糞中TCs的種類(lèi)及檢出率如表1所示。

圖1 常見(jiàn)的四環(huán)素類(lèi)抗生素(TCs)分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The molecular structures of common tetracycline antibiotics (TCs)

表1 國(guó)內(nèi)不同地區(qū)豬糞中檢測(cè)到的TCs種類(lèi)及檢出率Table 1 The detected types and detection rate of TCs in the domestic pig feces from different areas

1.2 豬糞堆肥中理化參數(shù)的調(diào)控

堆肥處理是豬糞中TCs降解的常用方法，而實(shí)際生產(chǎn)中，豬糞堆肥中TCs的降解又是一復(fù)雜過(guò)程，受多重理化參數(shù)的影響[27]。Mitchell等[28]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥中TCs的降解程度與堆體濕度、溫度、總氮、總磷和C/N等理化參數(shù)間存有很大的相關(guān)性。當(dāng)豬糞堆體含水率>70%時(shí)，堆體孔隙率降低，氧氣透氣量下降，不利于好氧發(fā)酵；當(dāng)堆體含水率<40%時(shí)，好氧微生物的生理活性將會(huì)受到影響[29]。常會(huì)慶等[30]在不同溫度下對(duì)脫水污泥堆肥，發(fā)現(xiàn)堆體環(huán)境溫度對(duì)微生物的活性、有害物質(zhì)的降解等具有重要影響，25 ℃比10 ℃更有利于有機(jī)質(zhì)降解和污泥堆體的腐熟。相反，Huang等[31]通過(guò)定量PCR和16s RNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，高溫條件下豬糞中適度的抗生素殘留，對(duì)豬糞微生物可產(chǎn)生短暫的抑制作用，但是在堆糞過(guò)程中如果不能有效地抑制病原體和抗性基因轉(zhuǎn)移，高溫并不一定能更好地去除糞中抗生素的ARGs。此外，儲(chǔ)意軒等[32]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在堆肥過(guò)程中，糞中微生物代謝有機(jī)酸的產(chǎn)生或揮發(fā)、有機(jī)氮的分解和氨氣的釋放均可使堆體pH發(fā)生變化，對(duì)豬糞中TCs的降解產(chǎn)生不同程度的影響。有研究表明，豬糞堆肥中添加不同比例的生物炭，可使堆體提前3 d進(jìn)入高溫期，堆體生物炭總氮含量增加。高溫條件下，當(dāng)堆體中C/N含量降低時(shí)，豬糞中的氮會(huì)以氨氣的形式揮發(fā)；當(dāng)堆體C/N超過(guò)35時(shí)，糞中微生物需進(jìn)行多次代謝循環(huán)，導(dǎo)致降解速度下降[33-34]。周思等[35]在豬糞中添加鋸末和秸桿調(diào)控豬糞中C/N時(shí)，發(fā)現(xiàn)初始C/N為(23～27)∶1時(shí)，堆肥效果最好。因此，豬糞堆肥中理化參數(shù)的調(diào)控對(duì)豬糞中抗生素的降解至關(guān)重要。豬糞堆肥過(guò)程中堆體常見(jiàn)的理化參數(shù)控制值如表2所示。

2 豬糞中ARGs的水平傳播(Horizontal transmission of ARGs in pig manure)

豬糞不經(jīng)堆肥處理直接作為有機(jī)肥在農(nóng)田中使用，給豬糞中抗生素ARGs的傳播、后續(xù)環(huán)境中重金屬含量的增加埋下了潛在的風(fēng)險(xiǎn)[46-47]。豬糞作為T(mén)Cs的有機(jī)載體，含有多種病原微生物和營(yíng)養(yǎng)養(yǎng)分，也是四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs重要的富集位點(diǎn)。TCs的污染及ARGs水平轉(zhuǎn)移對(duì)致病菌耐藥性的快速傳播起著重要作用?？股剡M(jìn)入環(huán)境后，會(huì)發(fā)生吸附、水解、光解和微生物降解等過(guò)程，將直接影響抗生素的生態(tài)毒性[48]。Huang等[49]研究發(fā)現(xiàn)，雨季時(shí)，畜牧區(qū)地表水和地下水中存在嚴(yán)重的ARGs污染，可能會(huì)構(gòu)成生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)并引發(fā)食品安全問(wèn)題。其次，豬糞中ARGs不僅可借助細(xì)菌的特異性同源重組，還可通過(guò)基因傳播元件(質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列和基因組島)等實(shí)現(xiàn)菌種間的水平轉(zhuǎn)移[50-51]。同時(shí)，TCs是疏水性有機(jī)物，可與碳基材料、納米材料、高分子聚合材料、分子印跡材料和礦物質(zhì)等諸多物質(zhì)發(fā)生吸附作用[52-54]。樓晨露[55]對(duì)我國(guó)4個(gè)長(zhǎng)期施用豬糞和不施用豬糞的定位試驗(yàn)點(diǎn)的表層和剖面土壤進(jìn)行采樣，發(fā)現(xiàn)TCs在長(zhǎng)期施用豬糞稻田土壤表層有累積效應(yīng)。與不施用豬糞的土壤相比，施用豬糞的土壤ARGs豐度明顯提高，TCs污染可從表層土壤向深層土壤遷移。Guo等[56]通過(guò)色譜質(zhì)譜及實(shí)時(shí)定量PCR這2種方法抽檢長(zhǎng)期施用有機(jī)肥的表層土壤，發(fā)現(xiàn)土壤中存有鋅、銅重金屬污染，且ARGs含量顯著增加。當(dāng)前受堆肥原料及環(huán)境條件的限制，豬糞還不能達(dá)到無(wú)害化利用的要求。分析豬糞中TCs的來(lái)源及ARGs傳播途徑，是減少豬糞中TCs的重要方法。豬糞中TCs的來(lái)源及其潛在的轉(zhuǎn)移途徑如圖2所示。

3 豬糞中TCs的生物轉(zhuǎn)化(Biotransformation of TCs in pig manure)

3.1 豬糞堆肥中微生物與TCs的相互作用

微生物降解是豬糞中TCs削減的一種重要方式，同時(shí)堆肥過(guò)程中微生物群落的變化也是豬糞中TCs抗性基因變異的主要驅(qū)動(dòng)因素。張凱煜[57]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥過(guò)程中TCs能改變豬糞中細(xì)菌、真菌的多樣性，使升溫期內(nèi)微生物的活性增加，TCs的降解加速。時(shí)紅蕾[58]研究發(fā)現(xiàn)，隨著豬糞堆肥中TCs濃度的增加、堆體溫度的改變，糞中微生物的代謝活性將受到抑制，微生物群落的多樣性指數(shù)逐漸下降。馬駿[59]利用添加TCs的豬糞和小麥秸稈進(jìn)行堆肥，發(fā)現(xiàn)豬糞中微生物的活性和碳源呈先下降后升高的趨勢(shì)，TCs的降解率達(dá)97.9%?？梢?jiàn)，豬糞堆肥中微生物與抗生素可產(chǎn)生互作效應(yīng)，對(duì)糞中微生物的代謝、抗生素的削減可產(chǎn)生不同程度的影響。

3.2 豬糞堆肥中四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs的降解

豬糞中殘留的抗生素進(jìn)入環(huán)境后可產(chǎn)生ARGs，ARGs可通過(guò)豬糞轉(zhuǎn)移，水平傳播。王曉慧等[60]對(duì)不同階段的豬糞進(jìn)行堆肥，發(fā)現(xiàn)豬糞中四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs檢出率大小順序依次為成年豬糞>幼豬糞>堆肥豬糞>土壤。李海超[61]在堆料中添加不同比例的生物炭，發(fā)現(xiàn)生物炭對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs中的tetC、tetG、tetW和tetX豐度有顯著影響。Kang等[62]研究發(fā)現(xiàn)，豬糞經(jīng)過(guò)4 d的短期高溫堆肥處理，豬糞中四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs不能被完全去除，但短暫的高溫對(duì)豬糞中殘留的四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs在土壤中的積累和擴(kuò)散具有控制作用。Zhang等[63]在堆料中加入木屑、稻殼和蘑菇殘?jiān)?，在同溫條件下進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)能通過(guò)改變微生物菌群，增強(qiáng)抗生素和ARGs去除的潛力，其去除率為14.9%～33.4%。也有研究表明，豬糞在堆肥過(guò)程中，糞中的磺胺類(lèi)藥物也會(huì)對(duì)糞中TCs及相關(guān)ARGs的降解產(chǎn)生影響[64]。Mao等[65]用竹炭和2種菌粉加入豬糞進(jìn)行堆肥實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溫度和有機(jī)碳含量可對(duì)細(xì)菌降解TCs產(chǎn)生影響。可見(jiàn)，堆肥可在很大程度上降低糞肥中四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs。糞中優(yōu)勢(shì)菌群的篩選、最適溫度調(diào)控和外來(lái)環(huán)境因子的影響對(duì)抗生素的降解也非常關(guān)鍵。

圖2 豬糞中TCs的來(lái)源及其潛在的轉(zhuǎn)移途徑Fig. 2 Sources of TCs in pig manure and their potential transfer pathways

表2 常見(jiàn)豬糞堆肥時(shí)的理化參數(shù)控制值Table 2 The values of physical and chemical parameters in common pig manure composting

3.3 豬糞堆肥中微生物菌群的變化

豬糞堆肥中抗生素削減的同時(shí)，伴隨著微生物的變化。而微生物不僅是ARGs的攜帶者，也是糞中抗生素降解的參與者。據(jù)報(bào)道，豬糞堆肥中微生物菌群對(duì)堆肥過(guò)程中溫度的調(diào)控起主導(dǎo)作用，豬糞中微生物及其產(chǎn)生的酶也是有機(jī)物降解的關(guān)鍵[66]。黃雅楠等[67]研究發(fā)現(xiàn)，豬糞堆肥過(guò)程中微生物與理化因子相互作用，優(yōu)勢(shì)菌梭菌屬菌豐度從最初的6.94%增加至高溫階段的18.56%，腐熟期后降低至0.62%。曹云等[68]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥前期微生物數(shù)量變化趨勢(shì)基本相同，嗜溫菌豐度呈現(xiàn)先升高后下降，嗜熱菌豐度隨堆肥溫度逐漸上升；同時(shí)，嗜熱性纖維分解菌對(duì)堆體持續(xù)高溫、加速有機(jī)質(zhì)降解有促進(jìn)作用。張海濱等[69]研究發(fā)現(xiàn)，堆肥中微生物種類(lèi)繁多，不同的堆肥原料可產(chǎn)生菌群差異。堆體纖維素的降解速度直接影響腐熟進(jìn)程，優(yōu)勢(shì)菌可減少堆肥中的氮素流失。肖禮等[39]在豬糞中添加白腐真菌及其混合外源菌劑，單一白腐真菌處理下的豬糞中銨態(tài)氮的降解最小；四環(huán)素和土霉素的含量隨堆肥時(shí)間顯著下降，經(jīng)過(guò)42 d后2種抗生素降解率可達(dá)90%以上(OTC、TC濃度<5 mg·kg-1)?？梢?jiàn)，豬糞堆肥中微生物菌群的變化可影響豬糞中抗生素的削減。

4 豬糞堆肥中TCs的降解(Degradation of TCs in pig manure compost)

4.1 堆肥方式對(duì)TCs降解的影響

畜禽污染已成為農(nóng)業(yè)面源污染的主要來(lái)源和重要成因?？股匾坏┙?jīng)豬體代謝進(jìn)入環(huán)境后，便會(huì)隨土壤、水和沉積物重新分布。目前，畜禽糞污處理和資源化利用主要有3種模式：能源化利用、肥料資源化利用和工業(yè)化處理。當(dāng)前農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、豬糞集中排放和規(guī)?；幚硪阎饾u成為一種趨勢(shì)[70]。四環(huán)素類(lèi)抗生素在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生代謝及降解產(chǎn)物，與母體相比，雖然活性降低，但毒性卻增強(qiáng)[71]。Winckler和Grafe[72]給豬口服四環(huán)素5 d，定期收集排泄物，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束2 d后的排泄物中，含72%四環(huán)素的活性成分。鹽酸四環(huán)素在豬糞中表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性，半衰期在55～105 d之間。豬糞堆肥化處理中，主要有好氧堆肥和厭氧堆肥，好氧堆肥是當(dāng)前較為常見(jiàn)的技術(shù)，堆肥效果也更好[73]。研究表明，不同堆肥方式對(duì)TCs的降解去除效果可產(chǎn)生不同程度的影響(表3)。

表3 不同堆肥方式對(duì)豬糞中TCs的降解效果Table 3 Degradation of TCs in pig manure by different composting methods

4.2 堆肥中TCs的生物降解

豬糞中TCs的生物降解主要依賴(lài)于糞中微生物的活動(dòng)。豬糞中抗生素的結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)作用在微生物的作用下可發(fā)生一系列復(fù)雜的改變，不僅會(huì)產(chǎn)生有毒次生代謝產(chǎn)物，還有碳水化合物[79]。豬糞堆肥中TCs的高效降解，優(yōu)勢(shì)耐藥細(xì)菌菌株在其中發(fā)揮了很大的作用。成潔等[80]在畜禽糞便池底部采集樣品，進(jìn)行平板涂布實(shí)驗(yàn)，得到木糖氧化無(wú)色桿菌對(duì)CTC、TC和OTC的降解率分別為65.5%、63.9%和58.3%。吳學(xué)玲等[81]從豬場(chǎng)糞便沉積池污泥中分離出的拉烏爾菌屬的菌株，在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生表面活性劑，可對(duì)TCs進(jìn)行高效降解，降解率>70.68%。其次，Liu等[82]采用無(wú)土栽培技術(shù)，發(fā)現(xiàn)生姜生長(zhǎng)能削減環(huán)境中的TCs，其中生姜中根、莖根、莖和葉TCs殘留量依次為：28.1、15.3、2.4和0.9 mg·kg-1。因此，豬糞中降解TCs的微生物來(lái)自多個(gè)方面，經(jīng)過(guò)生物降解能在佷大程度上降低豬糞中TCs的比例，促進(jìn)堆肥腐化進(jìn)程，提高堆肥產(chǎn)品養(yǎng)分含量和堆肥品質(zhì)。

4.3 堆肥中TCs的非生物降解

TCs在堆肥中可發(fā)生不同的吸附過(guò)程，且可在光、水及與化學(xué)物質(zhì)作用中發(fā)生非生物降解。王攀攀等[83]對(duì)豬糞沼液中TCs進(jìn)行光降解處理，發(fā)現(xiàn)不同波長(zhǎng)光源中TCs的降解效果為：高壓汞燈>紫外消毒燈>長(zhǎng)弧氙燈>無(wú)光。用高壓汞燈照射2 h后，糞中TC、OTC和CTC的降解率可達(dá)91.68%、85.58%和81.18%。Wu等[84]研究發(fā)現(xiàn)，在堆肥過(guò)程中添加酸性磷酸鹽，可控制氮損失和抑制有機(jī)物轉(zhuǎn)化，因此，預(yù)期會(huì)優(yōu)化堆肥效果。生物炭是一種良好的土壤改良劑，具有較強(qiáng)的氧化還原活性，對(duì)環(huán)境中的污染物有很好的吸附作用。Wang等[85]研究發(fā)現(xiàn)，稻草生物炭的吸附能力高于豬糞生物炭，且隨著熱解溫度的升高而增大。另外，生物炭在好氧堆肥過(guò)程中能提高堆體溫度，激活纖維素酶、脲酶活性，降低抗性基因tetC、tetG、tetW和tetX豐度[20]。臭氧氧化也是一種降解TCs的有效方法。Khan等[86]發(fā)現(xiàn)TCs經(jīng)臭氧氧化4～6 min后水溶液中TCs可完全去除。其中，臭氧可對(duì)TCs雙鍵、芳香環(huán)和氨基進(jìn)行修飾，使產(chǎn)物的m/z值發(fā)生變化。自由基可與TC的臭氧化產(chǎn)物發(fā)生非選擇性反應(yīng)。豬糞堆肥中TCs的非生物降解，也是促使豬糞中TCs降解的一種方法。

5 結(jié)論與展望(Conclusion and prospect)

近年來(lái)，畜禽糞便堆肥化處理已逐漸成為一種趨勢(shì)。在高濃度抗生素抗性選擇壓力條件下，豬糞妥善處理、抗生素的高效降解顯得尤為重要。如今養(yǎng)豬生產(chǎn)上用藥名錄繁多，且糞尿干濕、雨污未能有效分流，這給豬糞堆肥處理增加了難度。基于近年來(lái)豬糞堆肥最新的研究進(jìn)展，對(duì)當(dāng)前我國(guó)豬糞堆肥中存在的突出問(wèn)題，可在以下幾個(gè)方面尋找突破：(1)豬糞中TCs的降解是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，主導(dǎo)TCs降解的微生物在堆肥中起很大作用，能抑制四環(huán)素類(lèi)抗生素ARGs的水平轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。因此，在豬糞堆肥過(guò)程中篩選TCs降解的優(yōu)異菌株，同時(shí)堆肥中結(jié)合生物與非生物降解技術(shù)，可進(jìn)一步提高豬糞堆肥中TCs的降解效果。(2)豬糞堆肥后，豬糞中殘留的抗生素尚不能得到全部降解，殘留的四環(huán)素類(lèi)抗生素代謝的中間產(chǎn)物和微生物有毒代謝產(chǎn)物需得到進(jìn)一步降解，才能實(shí)現(xiàn)糞肥在土壤中的無(wú)害化利用。(3)我國(guó)每年養(yǎng)豬生產(chǎn)上抗生素的用量和種類(lèi)不斷變化。對(duì)豬群不同飼養(yǎng)階段飼用抗生素的用量及豬群TCs的代謝情況進(jìn)行調(diào)查，探究豬糞便、污水及土壤中TCs的生態(tài)毒性，指導(dǎo)豬糞堆肥效果的進(jìn)一步優(yōu)化。

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