耿檸波，任曉倩,2，張海軍,#，曹蓉，宋肖垚，羅云,2，張保琴，陳吉平,*

1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

環(huán)境毒理學(xué)是利用毒理學(xué)方法，研究環(huán)境污染物對(duì)人體健康的影響及其機(jī)理的學(xué)科，環(huán)境毒理學(xué)的主要任務(wù)是研究環(huán)境污染物對(duì)機(jī)體造成的損害和作用機(jī)理，探索環(huán)境污染物作用于機(jī)體后出現(xiàn)的生物學(xué)變化，尋找環(huán)境污染物對(duì)人體健康損害的早期觀察指標(biāo)，定量評(píng)定有毒環(huán)境污染物對(duì)機(jī)體的影響?！?1世紀(jì)毒理學(xué)測(cè)試新方法”倡導(dǎo)用毒性通路的理念來闡述毒物的毒性作用[1]?；蚪M學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其高通量篩選特征和靈敏的檢測(cè)能力使其在污染物的毒性通路和作用機(jī)制研究上具備很大的優(yōu)勢(shì)[2]，已成為環(huán)境毒理學(xué)研究必不可少的工具。組學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能從細(xì)胞和個(gè)體乃至物種的整體水平來解釋生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律，比傳統(tǒng)毒理學(xué)研究更具有整體性和系統(tǒng)性。

人類基因組實(shí)現(xiàn)了約20 687個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的鑒定[3]。然而，僅僅獲取了人類基因組的全部序列依然不能充分全面地闡釋復(fù)雜多變的生物過程。蛋白質(zhì)作為基因的產(chǎn)物，是細(xì)胞內(nèi)的活性分子。雖然細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和基因之間并不是嚴(yán)格的線性關(guān)系，但是，蛋白質(zhì)組學(xué)作為基因組學(xué)的重要補(bǔ)充，可以幫助我們揭示生命活動(dòng)的本質(zhì)，更好地理解疾病相關(guān)的藥物機(jī)制。因此，在20世紀(jì)90年代，致力于實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體所有蛋白質(zhì)的定性和定量分析的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而生[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞或機(jī)體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律的學(xué)科，其最為突出的特點(diǎn)是通過特定的蛋白質(zhì)分離手段并結(jié)合高通量分析鑒定技術(shù)，有效地研究特定情況下的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，基于質(zhì)譜技術(shù)的分析策略已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)[5]。近年來，基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)在污染物低劑量暴露、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)以及復(fù)合污染研究等領(lǐng)域發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和研究策略(Research methods and strategies of proteomics)

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的定義最早起源于1995年，是Wilkins等[6]根據(jù)“蛋白質(zhì) (protein)”和“基因組學(xué)(genomics)”組合提出。蛋白質(zhì)組學(xué)以整體、動(dòng)態(tài)和定量的原則來研究各種蛋白質(zhì)的功能，包含生物體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的鑒定與定量，系統(tǒng)地分析生物體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞定位、蛋白-蛋白相互作用、翻譯后修飾以及不同時(shí)間、空間和細(xì)胞類型間的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等。與基因組學(xué)的研究結(jié)果相比，蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能從細(xì)胞和個(gè)體乃至物種的整體水平來解釋生命現(xiàn)象的本質(zhì)和規(guī)律。因此，比基因組學(xué)的研究更具有廣度和挑戰(zhàn)性，已經(jīng)成為后基因組時(shí)代的重要學(xué)科。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是利用二維凝膠電泳(2D-DIGE)對(duì)細(xì)胞或組織中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離[7]，該方法的優(yōu)點(diǎn)是在一次實(shí)驗(yàn)中就能得到上千個(gè)蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)，可以涵蓋分子量從10 000～300 000 Da的蛋白質(zhì)。但由于對(duì)分離得到的蛋白質(zhì)無法進(jìn)行高靈敏并且快速的鑒定，限制了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展；傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測(cè)序主要基于蛋白質(zhì)N端的Edman化學(xué)降解實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和肽段序列的鑒定[8]，相較于基因組學(xué)中快速靈敏的自動(dòng)測(cè)序技術(shù)，該方法實(shí)驗(yàn)過程繁瑣而且通量很低，嚴(yán)重制約著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展。20世紀(jì)80年代末，質(zhì)譜儀器發(fā)生了兩大技術(shù)突破，使得蛋白質(zhì)分析發(fā)生了革命性的改變。這2種技術(shù)就是軟電離技術(shù)：電噴霧離子化(ESI)技術(shù)[9]和基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)技術(shù)[10]，這2種離子化技術(shù)解決了蛋白質(zhì)或者肽段等不易揮發(fā)的生物大分子難以實(shí)現(xiàn)高靈敏度離子化的難題，發(fā)明這2種技術(shù)的科學(xué)家美國(guó)的芬恩(John Fenn)和日本的田中耕一(Koichi Tanaka)，也因此被授予了2002年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，以表彰他們分別在發(fā)展ESI和MALDI技術(shù)方面做出的杰出貢獻(xiàn)。這2種軟電離技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，在蛋白質(zhì)和多肽分析中展現(xiàn)出了樣品用量少、通量高、操作簡(jiǎn)單和鑒定準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一。

質(zhì)譜儀主要包括離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器3個(gè)部分。軟電離技術(shù)的出現(xiàn)拓展了質(zhì)譜的應(yīng)用空間，質(zhì)量分析器的改善推動(dòng)了質(zhì)譜儀技術(shù)的發(fā)展。質(zhì)譜技術(shù)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的基本原理是，蛋白質(zhì)和肽段分子離子化后形成分子離子峰，質(zhì)譜儀器準(zhǔn)確地檢測(cè)其質(zhì)荷比(m/z)以及相應(yīng)的價(jià)態(tài)，得到其分子量信息并進(jìn)一步結(jié)合母離子豐富的多級(jí)碎片離子峰，確定蛋白質(zhì)或者肽段的氨基酸序列。目前，MALDI和ESI離子化技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)分析中廣泛使用的2種電離技術(shù)[11]。這2種離子化方式可以實(shí)現(xiàn)生物分子的高效離子化，而不會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，故被稱為“軟”電離技術(shù)。MALDI離子化技術(shù)，是將待測(cè)樣品與基質(zhì)分子形成共結(jié)晶薄層，在激光的照射下，樣品分子吸收基質(zhì)的能量和質(zhì)子，快速形成氣態(tài)離子實(shí)現(xiàn)離子化。ESI離子化技術(shù)則采用高壓電場(chǎng)將分析物溶液形成高電荷密度的微小霧滴，隨著霧滴中溶劑分子的進(jìn)一步揮發(fā)，實(shí)現(xiàn)樣品溶液的離子化，因此，ESI技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用，用于分析復(fù)雜的生物樣品。MALDI-MS技術(shù)通常用來分析相對(duì)簡(jiǎn)單的肽段混合物。

質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀中的核心技術(shù)。目前，常用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的質(zhì)量分析器主要有4種：離子阱(IT)、飛行時(shí)間(TOF)、四極桿(Q)和傅立葉變換離子回旋共振(FT-ICR)[12]。它們的結(jié)構(gòu)和性能各不相同，每一種都有自己的長(zhǎng)處與不足[13]。它們可以單獨(dú)使用，也可以互相組合形成功能更強(qiáng)大的儀器。其中，離子阱質(zhì)譜靈敏度高，掃描速度快，性能穩(wěn)定，具備多級(jí)質(zhì)譜能力，因此，被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究，其不足之處是質(zhì)量精度較低；FT-ICR也屬于阱類的質(zhì)量分析器，是目前世界上分辨率最高、質(zhì)量準(zhǔn)確度最高的質(zhì)譜儀，其腔體內(nèi)部為高真空和高磁場(chǎng)環(huán)境，具有非常高的靈敏度以及動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，但它異常昂貴的造價(jià)與操作的復(fù)雜性限制了它在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用；MALDI通常與TOF質(zhì)量分析器聯(lián)用分析肽段的精確質(zhì)量，而ESI常與離子阱或三級(jí)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID)獲取肽段的碎片信息。為了實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)及相關(guān)多肽的高通量準(zhǔn)確鑒定，商品化質(zhì)譜儀采用串聯(lián)或并聯(lián)的模式將多個(gè)或多種質(zhì)量分析器進(jìn)行組合，例如三重四級(jí)桿(QQQ)、四級(jí)桿-飛行時(shí)間聯(lián)用(Q-TOF)、三重四級(jí)桿-飛行時(shí)間聯(lián)用(QQQ-TOF)和飛行時(shí)間聯(lián)用(TOF-TOF)等。一系列基于靜電場(chǎng)軌道阱(Orbitrap)的質(zhì)譜儀、線性離子阱-靜電場(chǎng)軌道離子阱聯(lián)用(LTQ-Orbitrap)和四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱聯(lián)用(Q Exactive)等[14]，因質(zhì)量分辨率和準(zhǔn)確度的大大改善，尤其是儀器尺寸上的減小，運(yùn)行成本的降低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為了蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域廣泛使用的質(zhì)譜儀。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略

基于生物質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究策略主要可以分為2種：自上而下(top-down)和自下而上策略(bottom-up)(圖1)[15]。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)，不經(jīng)過蛋白質(zhì)酶解的過程，直接對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。完整蛋白首先通過PAGE或免疫富集法從復(fù)雜的生物樣本中分離，然后直接用ESI或MALDI技術(shù)生成離子。生成的離子經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)、高能量碰撞誘導(dǎo)解離(HCD)、電子捕獲解離(ECD)或電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)等方式碎裂，并在串聯(lián)質(zhì)譜中分析?！白陨隙隆毖芯坎呗阅芴峁┽槍?duì)完整蛋白質(zhì)的更精準(zhǔn)、更豐富的生物學(xué)信息，而且能夠保留多種翻譯后修飾之間的關(guān)聯(lián)信息，所鑒定到的蛋白質(zhì)更接近于其在生物體內(nèi)的真實(shí)狀態(tài)[16]，在蛋白鑒定、分析、序列解析及翻譯后修飾表征方面具有潛在的研究?jī)?yōu)勢(shì)。但是，該策略還面臨著很多的技術(shù)挑戰(zhàn)，包括蛋白質(zhì)混合物的分離困難、離子化效率低、質(zhì)譜碎裂效果差、質(zhì)譜譜圖的數(shù)據(jù)處理困難以及對(duì)質(zhì)譜儀器的要求極高等。

圖1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究的2個(gè)主要策略(“自上而下”和“自下而上”)[15]注：MS表示一級(jí)質(zhì)譜，MS/MS表示二級(jí)質(zhì)譜。Fig. 1 Two major strategies for the proteomics: The “top-down” and “bottom-up” [15]Note: MS stands for primary mass spectrum，MS/MS stands for secondary mass spectrometry.

“自下而上”的策略首先是從生物樣品中高效地提取蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，然后利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定分析，最后通過數(shù)據(jù)庫檢索的或者采用從頭測(cè)序法對(duì)質(zhì)譜譜圖進(jìn)行解析，從而獲取完整蛋白質(zhì)的信息，是一種間接鑒定的策略。其中，質(zhì)譜對(duì)肽段的有效鑒定主要是通過獲得肽段的相對(duì)分子質(zhì)量和碎片離子信息來實(shí)現(xiàn)。首先，通過一級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得肽段母離子的質(zhì)荷比，再通過串聯(lián)質(zhì)譜分析，獲得一系列肽段碎片離子信息。二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜得到的圖譜能夠?yàn)槲覀兲峁┠繕?biāo)肽段的序列信息和翻譯后的修飾信息。“自下而上”的研究策略分為基于多維液相色譜分離技術(shù)平臺(tái)的“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)(shotgun proteomics)和以特定目標(biāo)物為分析對(duì)象的靶標(biāo)蛋白質(zhì)組學(xué)(target proteomics)[17]。前者的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖氰b定的蛋白質(zhì)越多越好，而后者僅對(duì)一小部分目標(biāo)肽段進(jìn)行高質(zhì)量精度、高重復(fù)性以及高準(zhǔn)確度的定性及定量研究，其中，“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用最為廣泛，又被稱為發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組學(xué)(discovery proteomics)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在環(huán)境毒理學(xué)研究中的應(yīng)用(Application of proteomic in environmental toxicology)

環(huán)境毒理學(xué)是一門研究外源性環(huán)境污染物毒性作用的學(xué)科。其主要任務(wù)是描述環(huán)境污染物的毒性作用、闡明毒作用機(jī)制以及開展化學(xué)物質(zhì)危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)等。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高通量的特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的高效快捷定量分析。將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和環(huán)境毒理學(xué)相結(jié)合，可從蛋白水平上研究外源性化合物對(duì)機(jī)體的毒作用機(jī)制，并從中篩選出具有較高特異型和靈敏度的蛋白標(biāo)志物，目前已廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。

2.1 重金屬毒性機(jī)制研究

重金屬通常指對(duì)生物體生長(zhǎng)發(fā)育有負(fù)面影響的有毒金屬，如鎘(Cd)、銅(Cu)、鉻(Cr)、鉛(Pb)、鎳(Ni)、錳(Mn)、鋅(Zn)以及危險(xiǎn)金屬如砷(As)、汞(Hg)。重金屬污染已經(jīng)給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來了嚴(yán)重威脅，本節(jié)綜述了近年來基于蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)重金屬在水生生物、動(dòng)物和植物毒性研究中的應(yīng)用。短期Cd(100 μg·L-1)暴露對(duì)貽貝(Bathymodiolusazoricus)蛋白質(zhì)組的影響較小。采用2D-DIGE分離蛋白，進(jìn)一步利用MALDI-TOF鑒定出12種差異蛋白，包括結(jié)構(gòu)蛋白、代謝蛋白和應(yīng)激反應(yīng)蛋白[18]。而不同蛤(Ruditapesphilippinarum)對(duì)Cd暴露的生物學(xué)響應(yīng)也不同，白蛤和斑馬蛤暴露于Cd(200 μg·L-1)后，對(duì)其蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明，白蛤中的差異表達(dá)蛋白(DEPs)多于斑馬蛤。Cd暴露共同誘導(dǎo)了2種蛤的一些關(guān)鍵生物學(xué)過程，包括免疫反應(yīng)和代謝。白蛤的一些與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)水解和能量產(chǎn)生有關(guān)的過程得到了增強(qiáng)。相比之下，斑馬蛤的蛋白質(zhì)水解和能量產(chǎn)生的某些過程耗竭，基因表達(dá)也出現(xiàn)了紊亂。此外，Cd暴露導(dǎo)致白蛤樣品中過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性增加，而斑馬蛤樣品中超氧化物歧化酶(SOD)和CAT活性降低[19]。采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究了雄性牡蠣(Crassostreaangulata)和雌性牡蠣對(duì)鋅暴露的不同反應(yīng)。在50 μg·L-1或500 μg·L-1Zn中暴露30 d后，雌性牡蠣性腺中的Zn累積量大于雄性牡蠣，雌性牡蠣性腺發(fā)育加快，但雄性牡蠣性腺發(fā)育不正常。雌牡蠣生殖腺中表達(dá)的半胱氨酸、組氨酸脫氫酶等具有鋅轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存功能的蛋白和多功能蛋白明顯高于雄牡蠣[20]。以水蚤(Daphniamagna)為模式生物研究了Pb2+和阿特拉津?qū)λ锏挠绊?。通過比較對(duì)照和脅迫條件下的蛋白圖譜，發(fā)現(xiàn)Pb2+和阿特拉津?qū)λ榈挠绊憥缀跸喾?；Pb2+抑制了大部分DEPs，而阿特拉津激活了大部分DEPs[21]。

大鼠連續(xù)5周暴露于Mn(200 mg·L-1)后，其總行走距離顯著降低，主要器官組織學(xué)結(jié)構(gòu)清晰，無病理學(xué)改變。而基于iTRAQ(isobaric tag for relative and absolute quantitation)蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)對(duì)3 012種腸道粘膜細(xì)胞Mn含量修飾蛋白進(jìn)行了定性和定量分析，共發(fā)現(xiàn)175種腸粘膜蛋白在Mn暴露下差異表達(dá)。這些蛋白與胰腺分泌、蛋白質(zhì)消化吸收、脂肪消化吸收、氨基酸生物合成、甘油脂代謝、阿爾茨海默病、帕金森病和礦物質(zhì)吸收相關(guān)[22]。Hg (HgCl2；0.1、1和5 mg·kg-1·d-1Hg)暴露后，對(duì)SD大鼠腎臟組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，硒結(jié)合蛋白1(SBP1)是Hg給藥后大鼠腎皮質(zhì)中上調(diào)最明顯的蛋白。另外，尿中SBP1的排泄量呈劑量依賴性顯著增加。采用HgCl2、CdCl2或順鉑處理正常腎近端小管細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)SBP1在化學(xué)誘導(dǎo)腎毒性的病理過程中發(fā)揮重要作用，尿中SBP1的排泄可作為早期腎損傷的生物標(biāo)志物[23]。A549細(xì)胞在外源Cd中暴露后，對(duì)其蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果表明，鑒定的53個(gè)差異蛋白根據(jù)其生物學(xué)過程進(jìn)行分類，主要涉及代謝過程、細(xì)胞過程、發(fā)育過程和細(xì)胞成分。根據(jù)蛋白的分子功能進(jìn)行分類，主要涉及催化活性和結(jié)合活性。同時(shí)，結(jié)果表明，Cd的毒性與必需金屬的替代、金屬貯存蛋白表達(dá)的抑制以及金屬主動(dòng)外排系統(tǒng)的激活有關(guān)[24]。對(duì)Pb、As和甲基汞(MeHg)混合暴露在海馬細(xì)胞蛋白質(zhì)水平上的相互作用進(jìn)行研究，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的基因功能和通路分析證實(shí)了與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、m-RNA剪接和泛素系統(tǒng)功能障礙相關(guān)的神經(jīng)退行性改變發(fā)生[25]。重金屬對(duì)海馬細(xì)胞的影響順序?yàn)镻b

蛋白質(zhì)組學(xué)研究能夠反映植物應(yīng)對(duì)重金屬污染的調(diào)控過程，展示主要參與細(xì)胞解毒和耐受機(jī)制的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和代謝途徑。大豆(GlycinemaxL.)植株分別暴露于Pb(30 μg·L-1)和Hg(0.5 μg·L-1)后，葉片和結(jié)節(jié)的氧化應(yīng)激水平均增加，抗壞血酸過氧化物酶(AsA-POD)、谷胱甘肽還原酶(GR)和CAT的活性也被調(diào)節(jié)。Pb和Hg分別對(duì)33種和43種蛋白質(zhì)有顯著影響。差異蛋白在功能上與多種細(xì)胞功能相關(guān)[29]。紫花苜蓿(Medicagosativa)長(zhǎng)期暴露于Cd(10 mg·kg-1)后，179個(gè)細(xì)胞壁蛋白和30個(gè)可溶性部分蛋白的豐度發(fā)生了變化。這些蛋白參與細(xì)胞壁重構(gòu)、防御反應(yīng)、碳水化合物代謝和促進(jìn)木質(zhì)化過程[30]?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)研究了菌株Q2-8誘導(dǎo)小麥植株Cd和As吸收減少的分子機(jī)制：菌株Q2-8通過提高Cd和As脅迫下根系能量代謝、防御和細(xì)胞壁生物合成的效率，減輕Cd和As對(duì)小麥幼苗的毒害，降低地上組織Cd和As的吸收。小麥根中差異表達(dá)的細(xì)胞壁生物合成相關(guān)蛋白僅存在于Cd脅迫下小麥植株中[31]。采用蛋白質(zhì)組對(duì)土壤中Ni、Cu和Zn對(duì)植物(OcimumbasilicumL.)的影響進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，Cu可導(dǎo)致致敏蛋白濃度升高，嚴(yán)重的Cu脅迫還會(huì)導(dǎo)致與蒸騰和光合作用相關(guān)的特定蛋白質(zhì)的積累，并得出Cu對(duì)該植株的危害最大、產(chǎn)生的過敏原最多的結(jié)論[32]。水稻(OryzasativaL.)幼苗對(duì)六價(jià)鉻(Cr6+)脅迫的蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，水稻對(duì)Cr6+脅迫的響應(yīng)具有劑量依賴性和組織特異性。鑒定出的64種蛋白質(zhì)參與一系列的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞壁合成、能量生產(chǎn)、初級(jí)代謝、電子傳遞和解毒。細(xì)胞壁是水稻抵抗Cr6+脅迫的重要屏障，水稻植株應(yīng)對(duì)Cr6+脅迫的策略包括將Cr離子固定在細(xì)胞壁中，減少其易位；激活抗氧化防御，減輕Cr6+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[33]。對(duì)鎘(Cd2+)、滲透脅迫及其復(fù)合脅迫下的短柄草(Brachypodiumdistachyon)幼苗葉片進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，采用2D-DIGE檢測(cè)到117個(gè)差異蛋白，包括參與光合作用/呼吸、能量和碳代謝、壓力/防御/解毒、蛋白質(zhì)折疊和降解以及氨基酸代謝的蛋白。Cd2+和復(fù)合脅迫對(duì)葉片蛋白質(zhì)組的影響大于單獨(dú)的滲透脅迫[34]。

2.2 有機(jī)污染物毒性機(jī)制研究

有機(jī)污染物種類繁多，且毒性較大，本節(jié)綜述了基于蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)典型有機(jī)污染物的毒理學(xué)研究。多環(huán)芳烴(PAHs)是一種高致癌性的污染物，往往在環(huán)境中長(zhǎng)期存在。為探討擬南芥(Arabidopsisthaliana)對(duì)多環(huán)芳烴中菲的氧化應(yīng)激反應(yīng)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出30種差異表達(dá)蛋白，其中，核苷二磷酸激酶3(NDPK-3)顯著上調(diào)，進(jìn)一步研究了NDPK-3過表達(dá)、敲除和野生型植物中應(yīng)激反應(yīng)酶的水平。NDPK-3過表達(dá)體中抗壞血酸過氧化物酶(APX)、CAT、POD和SOD活性均高于野生型；在NDPK-3敲除序列中，這些酶的活性降低。這些數(shù)據(jù)證實(shí)NDPK-3是擬南芥對(duì)PAHs脅迫響應(yīng)的正向調(diào)節(jié)因子[35]。采用2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS對(duì)菲暴露的小麥(TriticumaestivumL.)根蛋白進(jìn)行分析和鑒定。菲誘導(dǎo)上調(diào)的蛋白與植物的防御反應(yīng)、抗氧化系統(tǒng)和糖酵解有關(guān)；下調(diào)的蛋白質(zhì)涉及高能量化合物的代謝和植物生長(zhǎng)[36]。對(duì)小麥(TriticumaestivumL.)幼苗進(jìn)行菲暴露后進(jìn)行亞細(xì)胞觀察，結(jié)果表明，葉綠體發(fā)生逆轉(zhuǎn)，失去了結(jié)構(gòu)的完整性。采用iTRAQ分析了葉綠體蛋白質(zhì)譜的變化，共鑒定出517種蛋白，其中，8個(gè)與類囊體相關(guān)的蛋白被下調(diào)，相關(guān)基因的表達(dá)通過RT-PCR驗(yàn)證，證實(shí)了類囊體破壞是葉綠體變形的原因[37]。采用鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)大西洋鱈魚(Gadusmorhua)的血漿樣品進(jìn)行了分析，共鑒定了369種蛋白質(zhì)，在暴露于PAHs的魚類中，發(fā)現(xiàn)了12種蛋白水平的顯著變化，11種上調(diào)蛋白主要是免疫球蛋白，表明在暴露的魚體內(nèi)觸發(fā)了免疫反應(yīng)[38]。綿羊長(zhǎng)期飼養(yǎng)在污水污泥施肥的牧場(chǎng)上，檢測(cè)肝臟中的PAHs和多氯聯(lián)苯(PCBs)，同時(shí)采用二維差分凝膠電泳法對(duì)肝臟蛋白進(jìn)行分離，采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)環(huán)境化學(xué)品暴露影響了外源化合物脫毒反應(yīng)過程以及雄性和雌性綿羊的肝蛋白組，包括主要的血漿分泌蛋白和代謝酶。通路分析預(yù)測(cè)了癌癥相關(guān)通路的失調(diào)和脂質(zhì)代謝的改變[39]。用5種PAHs(芴、蒽、菲、氟和芘)對(duì)蚯蚓(Eiseniafetida)進(jìn)行暴露，并對(duì)<20 kDa的蛋白進(jìn)行分析，鑒定出54個(gè)差異蛋白。其中，3個(gè)差異蛋白在暴露于蒽和芘的蚯蚓中表達(dá)；一個(gè)蛋白選擇性地表達(dá)于暴露于芴、菲和熒蒽的蚯蚓中[40]。

蛋白質(zhì)組學(xué)為全氟辛烷磺酸(PFOS)毒性效應(yīng)的分子機(jī)制和生物標(biāo)志物研究提供了方法。斑馬魚胚胎暴露于PFOS(0.5 mg·L-1) 192 h后，采用2D-DIGE進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了69個(gè)差異蛋白，進(jìn)一步采用MALDI-TOF-MS對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。這些蛋白的功能包括解毒、能量代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)/類固醇代謝過程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡[41]。對(duì)歐洲杜父魚(Cottusgobio)進(jìn)行短期PFOS(0.1 mg·L-1或1 mg·L-1，96 h)暴露，然后采用2D-DIGE和nano-LC-MS/MS相結(jié)合的方法，鑒定出的差異表達(dá)蛋白包含了應(yīng)激反應(yīng)、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、能量代謝和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等功能[42]。歐洲鰻魚(Anguillaanguilla)外周血單核細(xì)胞(PBMC)體外暴露于PFOS(10 μg·L-1和1 mg·L-1，48 h)，共鑒定出48個(gè)不同功能類群的差異蛋白，涉及細(xì)胞骨架、蛋白折疊、細(xì)胞信號(hào)、蛋白水解途徑、碳水化合物和能量代謝[43]。另一項(xiàng)體內(nèi)暴露研究通過對(duì)比利時(shí)河流中不同PFOS污染程度的鰻魚(AnguillaanguillaL.)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，用2D-DIGE分離蛋白，進(jìn)一步利用nano-LC-MS/MS鑒定出17種差異蛋白，且在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，有3種相同的差異蛋白包括質(zhì)體-2、烯醇化酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶，可作為PFOS污染預(yù)警的生物標(biāo)志物[44]。采用胚胎干細(xì)胞試驗(yàn)來評(píng)估PFOS發(fā)育毒性(0 μmol·L-1，10 d)，蛋白質(zhì)組學(xué)分析共鑒定出176個(gè)差異蛋白，大多數(shù)蛋白質(zhì)主要與催化活性、細(xì)胞核定位或細(xì)胞成分有關(guān)。通路分析顯示，32條信號(hào)通路受到影響，尤其是代謝相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)果表明，PFOS是一種弱的胚胎毒性化學(xué)物質(zhì)，然而，指示發(fā)育毒性的幾個(gè)標(biāo)記蛋白(Brachyury、GATA4、MEF2C和α-actinin)在PFOS暴露組顯著下調(diào)，揭示了PFOS在發(fā)育性心血管系統(tǒng)中的潛在新靶點(diǎn)[45]。iTRAQ標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)也被應(yīng)用于PFOS的毒理學(xué)研究。PFOS暴露(1.0、2.5和5.0 mg·kg-1·d-1)7 d后小鼠肝臟的差異蛋白主要參與脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、生物合成過程以及對(duì)刺激的反應(yīng)[46]。人類肝細(xì)胞LO2暴露于PFOS(25～50 mg·L-1) 72 h后，蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果表明，PFOS能夠通過抑制HNRNPC、HUWE1、UBQLN1以及誘導(dǎo)PAF1參與p53和原癌基因的信號(hào)通路激活從而觸發(fā)凋亡過程[47]。另一個(gè)人肝細(xì)胞株(HL-7702)暴露于PFOS(50 μmol·L-148 h和96 h)后[48]，差異表達(dá)蛋白質(zhì)與細(xì)胞增殖有關(guān)，包括肝癌衍生生長(zhǎng)因子(Hdgf)和增殖標(biāo)志物Mk167和Top2α。

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類溴代芳香族化合物，脂溶性較強(qiáng)，易在生物體和人體內(nèi)蓄積。采iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)有PBDEs暴露風(fēng)險(xiǎn)的電子垃圾回收處理廠附近孕婦臍帶組織進(jìn)行分析，共鑒定出697個(gè)差異蛋白，主要參與機(jī)體抗氧化防御、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝過程。其中，CAT和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞色素C的表達(dá)下調(diào)，這些結(jié)果說明，PBDEs暴露導(dǎo)致的臍帶組織抗氧化失衡和細(xì)胞凋亡與新生兒不良出生結(jié)局有關(guān)[49]。在一項(xiàng)經(jīng)BDE-47暴露的大鼠的研究中，共鑒定出64個(gè)差異蛋白，其中，20個(gè)差異蛋白與細(xì)胞凋亡有關(guān)，15個(gè)差異蛋白位于線粒體內(nèi)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，BDE-47誘導(dǎo)了GC1-spg細(xì)胞凋亡、線粒體損傷，并且降低了Bcl-2蛋白表達(dá)。這些結(jié)果說明，BDE-47可能通過損害線粒體功能而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[50]。采用2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF-MS對(duì)經(jīng)BDE-209和/或BDE-47暴露的神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共鑒定出19個(gè)差異蛋白可以作為BDE-209和/或BDE-47暴露的潛在生物標(biāo)志物[51]。采用iTRAQ技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF/TOF-MS對(duì)經(jīng)BDE-47暴露的雌性和雄性海洋青鳉(Oryziasmelastigma)性腺蛋白進(jìn)行研究，在睪丸和卵巢中分別鑒定出133個(gè)和144個(gè)差異蛋白，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)和性別依賴特征。其中，睪丸中鑒定到42個(gè)顯著下調(diào)的蛋白可能會(huì)破壞精子的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致魚類不育；卵巢中鑒定到38種差異蛋白，卵黃蛋白原和載脂蛋白A-1的表達(dá)上調(diào)，這表明BDE-47是一種雌激素類似物，可導(dǎo)致魚類的生殖系統(tǒng)損傷[52]。Ji等[53]采用蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合的方法研究了BDE-47暴露對(duì)紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)的性別特異性反應(yīng)，代謝應(yīng)答響應(yīng)結(jié)果表明，BDE-47主要擾亂雄性紫貽貝鰓的能量代謝；雌性紫貽貝的滲透調(diào)節(jié)和能量代謝均受到了不同程度的擾亂。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，BDE-47誘導(dǎo)雌紫貽貝和雄紫貽貝的細(xì)胞凋亡和活性氧(ROS)生成減少；擾亂雄紫貽貝的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，此外也擾亂了雌紫貽貝的蛋白質(zhì)水解。另外，該團(tuán)隊(duì)基于代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)用的方法開展了BDE-47暴露對(duì)蚯蚓(Eiseniafetida)毒性效應(yīng)的研究，結(jié)果表明，BDE-47誘導(dǎo)蚯蚓細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷，擾亂了蛋白質(zhì)的生物合成與能量代謝[54]。

六溴環(huán)十二烷(HBCD)是一種溴代脂環(huán)類化合物，易在生物脂肪組織中富集，并通過生物鏈逐級(jí)放大。在一項(xiàng)為期28 d的BALB/c雌性幼鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，HBCD會(huì)導(dǎo)致幼鼠肝臟、胸腺和子宮組織發(fā)生病變，降低血清17β雌二醇(17β-E2)含量，增加血清睪酮/雌二醇比例。腦部蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，HBCD誘導(dǎo)HSPA8、G6PD和SIRT2蛋白表達(dá)失調(diào)，這些結(jié)果為HBCD降低雌二醇(E2)含量提供了分子機(jī)制支持[55]。采用2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF技術(shù)分別對(duì)甲狀腺機(jī)能正常和機(jī)能減退的雌性大鼠進(jìn)行研究，結(jié)果表明，HBCD暴露影響雌鼠肝臟功能和甲狀腺激素穩(wěn)態(tài)，同時(shí)影響了與糖異生/糖酵解、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)含量，誘發(fā)了氧化應(yīng)激反應(yīng)[56]。在另外一項(xiàng)關(guān)于大鼠低劑量短期暴露于HBCD的研究中，采用2D-DIGE對(duì)肝臟組織蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HBCD暴露引起大鼠肝臟蛋白質(zhì)組的變化具有性別差異，HBCD僅引起雄性大鼠肝臟組織中少量蛋白模式的改變；性別依賴性影響還表現(xiàn)在脂類代謝的差異上，主要原因是HBCD易積累在白色脂肪組織中，而雄性老鼠的脂肪組織含量較雌性老鼠高[57]。Rasinger等[58]評(píng)估了膳食暴露于持久性有機(jī)污染物是否會(huì)影響成年小鼠大腦的基因和蛋白表達(dá)，幼年雌性小鼠分別飼喂添加有二惡英類(DL)化合物2,3,7,8-四氯二苯并-p-二惡英(TCDD)、非二惡英類(NDL)化合物HBCD、BDE-47和CB-153的魚食28 d，結(jié)果表明，所有暴露組均導(dǎo)致大腦神經(jīng)基因和蛋白表達(dá)譜的改變?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)相關(guān)的生物信息學(xué)分析強(qiáng)調(diào)芳香烴受體(AHR)機(jī)制在DL化合物毒性效應(yīng)中的重要性，揭示了TCDD通過AHR靶向調(diào)控腦部鋅穩(wěn)態(tài)，而DL和NDL這2類物質(zhì)均會(huì)影響腦部鈣離子穩(wěn)態(tài)。蛋白質(zhì)組學(xué)分析數(shù)據(jù)沒有明確區(qū)分DL和NDL的影響差異，所有暴露組小鼠中與興奮毒性相關(guān)的蛋白含量都受到顯著影響。多組學(xué)綜合分析認(rèn)為，飲食中的污染物暴露破壞了小鼠血腦屏障，并在小鼠腦部蓄積，從而嚴(yán)重?cái)_亂鈣穩(wěn)態(tài)和鋅穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)興奮毒性。

2.3 空氣污染的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

近年來，空氣污染尤其是大氣顆粒物污染備受關(guān)注，對(duì)人類的生產(chǎn)生活和健康帶來了不利影響。采用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)空氣污染的研究也取得了一定的成果。采用人肺癌細(xì)胞株A549對(duì)鋼鐵工業(yè)環(huán)境中含有高濃度PAHs和金屬的顆粒物暴露并進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出1 576個(gè)蛋白，其中，196個(gè)蛋白發(fā)生了顯著變化。與氧化還原穩(wěn)態(tài)、代謝和細(xì)胞能量生成相關(guān)的蛋白受到抑制，而與DNA損傷和修復(fù)等脅迫相關(guān)的蛋白過度表達(dá)，腫瘤相關(guān)蛋白C1QBP、EWSR1、CAV1和CAPER的表達(dá)增加。推斷抑制細(xì)胞代謝和三磷酸腺苷(ATP)生成將損害細(xì)胞修復(fù)DNA損傷的能力。這可能是顆粒物誘發(fā)癌變的驅(qū)動(dòng)力[59]。采用基于LC-MS/MS的代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)以及iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究PM2.5暴露對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549的毒性效應(yīng)，代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PM2.5處理后，篩選出56種差異代謝物(40種含量升高，16種含量降低)、22種差異脂類物質(zhì)(19種含量升高，3種含量降低)和81種差異表達(dá)蛋白(55種含量上調(diào)，26種含量下調(diào))。蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，有16個(gè)蛋白與RNA剪接相關(guān)，主要是上調(diào)的絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1/2(SRSF-1/2)、小核核糖核蛋白70 kDa(snRNP70)、小核核糖核蛋白多肽B/C/E(SNRP-B/C/E)和下調(diào)的異質(zhì)核糖核酸蛋白(hnRNP UL2)。在代謝水平上，PM2.5暴露顯著擾亂了A549細(xì)胞神經(jīng)酰胺、絲氨酸、鞘氨醇和鞘磷脂的代謝。神經(jīng)酰胺的累積和RNA剪接的改變可以視為PM2.5毒理學(xué)評(píng)價(jià)的潛在標(biāo)志物[60]。在另一項(xiàng)研究中，采用2D-DIGE結(jié)合MALDI-TOF/TOF對(duì)經(jīng)PM2.5暴露的A549細(xì)胞的蛋白組進(jìn)行分析，鑒定出22種差異蛋白。結(jié)果表明，氧化應(yīng)激、代謝紊亂、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)、蛋白質(zhì)合成與降解以及細(xì)胞骨架破壞是PM2.5誘發(fā)細(xì)胞毒性的主要因素[61]。

蛋白質(zhì)也常被篩選出來作為空氣污染的標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織的蛋白質(zhì)組學(xué)特征與孕婦孕期接觸有毒物質(zhì)有關(guān)[62]。與對(duì)照組相比，生活在城市空氣污染環(huán)境中的母親胎盤中多環(huán)芳烴羥化酶(AHH)活性顯著升高[63]，AHH是多環(huán)芳烴最重要的代謝產(chǎn)物。而另外2種細(xì)胞解毒指標(biāo)GST和7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶(ECOD)與空氣污染水平的關(guān)系表現(xiàn)為：ECOD活性隨著環(huán)境空氣污染的增加而顯著增加，而相同條件下GST活性下降[64]。Sorkun等[65]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在空氣污染水平較高的地區(qū)，胎盤金屬硫蛋白(MT)的數(shù)量顯著增加，MT是一種重要的金屬固定和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在控制氧化應(yīng)激過程中起著重要的作用。胎盤蛋白質(zhì)組學(xué)的另一個(gè)應(yīng)用是作為篩查細(xì)胞能量代謝的指示物。丙酮酸激酶是糖酵解過程中的一種必需酶，在污染較嚴(yán)重地區(qū)的婦女胎盤組織中表現(xiàn)出顯著的活性增加[66]。子癇前期妊娠胎盤組織中這種蛋白水平也升高[67]，其特點(diǎn)是胎盤炎癥反應(yīng)過度，這與產(chǎn)前暴露于空氣污染中的結(jié)果相似。由于糖酵解是胎盤能量產(chǎn)生的一個(gè)重要途徑，懷孕期間空氣污染對(duì)這一關(guān)鍵途徑的影響需要給予更多關(guān)注。另外，蛋白降解或修飾產(chǎn)物也常作為妊娠期間胎盤損傷的生物標(biāo)志物。過氧亞硝酸鹽可將酪氨酸蛋白群修飾為3-硝基酪氨酸(3-NTp)，3-NTp是一種氧化應(yīng)激或亞硝化應(yīng)激的中間產(chǎn)物?；谌巳旱囊豁?xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，胎盤3-NTp水平與PM2.5和黑炭暴露正相關(guān)[68]。這一結(jié)果也在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，大鼠暴露于柴油尾氣污染的空氣中胎盤3-NTp水平升高[69]。

3 總結(jié)與展望(Summary and prospects)

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，為環(huán)境毒理學(xué)研究提供了新的思路和強(qiáng)有力的技術(shù)支持。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)高通量、高靈敏度的分析特征在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、環(huán)境污染物低劑量暴露和復(fù)合污染研究等領(lǐng)域發(fā)揮了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)高效樣品預(yù)處理技術(shù)，高準(zhǔn)確度、高覆蓋的定性與定量技術(shù)和數(shù)據(jù)解析技術(shù)的發(fā)展拓寬了蛋白質(zhì)組分析的應(yīng)用面，將這些新技術(shù)與新方法引入毒理學(xué)研究，將有助于全景式地揭示機(jī)體暴露于污染物的蛋白質(zhì)組調(diào)控規(guī)律。另外，目前，將蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)研究后，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些重要蛋白標(biāo)志物，但是從標(biāo)志物到作用機(jī)理還未發(fā)現(xiàn)確切的關(guān)聯(lián)。毒性作用通路是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，暴露于外源化學(xué)物是如何破壞這些路徑并最終導(dǎo)致了負(fù)的健康效應(yīng)，基因、蛋白和小分子代謝物相結(jié)合才能為毒理學(xué)評(píng)估提供綜合視角，系統(tǒng)揭示污染物的毒性作用機(jī)制。因此，蛋白組學(xué)與基因組學(xué)和代謝組學(xué)相結(jié)合，將會(huì)成為毒理學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)。

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