程應(yīng)鋒，杜遠(yuǎn)東，趙重博*，王 晶，曹林旭，劉 釘

(1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng)，712046；2陜西省中藥飲片工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712046；3漢中市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 漢中 723000)

花椒為蕓香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.和青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.的干燥成熟果皮，有很好的止痛作用[1]，在我國(guó)有廣泛的栽植。長(zhǎng)期的人工培育產(chǎn)生了一些列花椒優(yōu)勢(shì)品種，尤其以甘肅、陜西、山東等省最為出名，如陜西韓城的大紅袍等品種[2]?；ń酚刑厥獾穆槲逗拖阄叮彩侨粘Ｉ钪斜夭豢缮俚恼{(diào)味品，與桂皮、丁香、八角等被稱一起被稱為“八大味”[3]。花椒目前主要是作為農(nóng)副產(chǎn)品，經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高，深加工不夠。近幾年對(duì)花椒的麻味研究較多，花椒所含異丁基酰胺類化合物，尤其是羥基-α-山椒素作為麻味的主要物質(zhì)，被報(bào)道具有一定的神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)記憶的作用[4～5]。

花椒酰胺在國(guó)內(nèi)外已有較多報(bào)道，但多針對(duì)其麻味刺激和藥理作用，提取方面報(bào)道不多，多以機(jī)溶劑或超臨界萃取[6～8]，存在工藝復(fù)雜、設(shè)備昂貴等制約因素，不利于工業(yè)化推廣；且研究指標(biāo)單一，多采用紫外檢測(cè)麻味物質(zhì)。PB-CCD法是針對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響因素較多時(shí)常用的一種優(yōu)化方法，在天然產(chǎn)物提取工藝條件的優(yōu)化上，該方法以各因素的極端水平為試驗(yàn)所允許的極值，僅通過(guò)一次設(shè)計(jì)和計(jì)算即可得到顯著影響提取效率的因素，是篩選試驗(yàn)因素的較好設(shè)計(jì)方法[9]。因此本次實(shí)驗(yàn)選用更為簡(jiǎn)單的浸提工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以陜產(chǎn)花椒為研究對(duì)象，以花椒提取物得率、總酰胺的提取率和羥基-α-山椒素的含量為指標(biāo)優(yōu)化提取工藝，以期為陜產(chǎn)花椒的精深加工和綜合開(kāi)發(fā)提供借鑒。

1 材料與儀器

花椒購(gòu)自陜西省韓城市芝陽(yáng)花椒市場(chǎng)，為蕓香科植物花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim.的干燥成熟果皮。羥基-α-山椒素(HPLC≥98.0%, 批號(hào)M26M10D84025)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)中所用甲醇、中性氧化鋁及其它試劑均為分析純；色譜甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

YBS-1000密封粉碎機(jī)(上海綠翊機(jī)械制造有限公司)，524G 恒溫加熱磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)，XM-80超聲波清洗器(小美超聲儀器有限公司)，RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海岐耀儀器設(shè)備有限公司)，TDL-5A低速離心機(jī)(金城海瀾儀器制造廠)，BT 25S型1/10萬(wàn)分析天平(賽多利斯上海貿(mào)易有限公司)，UV1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海之信儀器有限公司)，沃特斯2695高效液相色譜儀，配2996DAD檢測(cè)器，Empower工作站(美國(guó)Waters公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)流程

花椒→粉碎→過(guò)篩→浸提→純化→干燥→提取物。

2.2 花椒總酰胺含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羥基-α-山椒素對(duì)照品10 mg，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加少量甲醇超聲待充分溶解后，再加甲醇補(bǔ)足至刻度線，即得濃度為0.1 mg·mL-1的對(duì)照品溶液母液，用錫箔紙包裹嚴(yán)密，置于冰箱中，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液的制備 花椒提取物制備：參考文獻(xiàn)[10]的方法制備花椒酰胺提取物，稱取花椒粉末100 g(過(guò)三號(hào)篩)，加10倍量甲醇，以60 rpm的轉(zhuǎn)速在50℃浸提4 h，過(guò)濾。將濾液減壓濃縮至一定體積，過(guò)堿性氧化鋁層析柱，收集流出液混合至一處，4 000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液回收甲醇，低溫干燥即得花椒提取物13.3675 g，室溫條件下保存于干燥器內(nèi)。

供試品制備：精密稱取花椒提取物10 mg置于棕色三角瓶中，加100 mL甲醇，稱定重量，超聲30 min，室溫放涼，加甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾即得供試品溶液，用錫箔紙包裹嚴(yán)密，置于冰箱中，避光保存。

2.2.3 最大吸收波長(zhǎng)掃描 吸取羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液置于石英皿中，以甲醇的石英皿為空白對(duì)照，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在270 nm處波有最大吸收值，故選用270 nm作為總酰胺含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.4 線性關(guān)系考察 將羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液依次稀釋為濃度為20 μg·mL-1、16 μg·mL-1、12μg·mL-1、10μg·mL-1、8μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，在270 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)溶液的吸光度值。以紫外吸光度為Y值，以不同羥基-α-山椒素濃度為X值，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y = 43.164X-0.1084，r=0.9995， 表明羥基-α-山椒素濃度在8～20 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 將同一濃度羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液，在270 nm處重復(fù)測(cè)定吸光度6次，計(jì)算RSD值為0.25%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份花椒提取物，每份10 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下“置于棕色三角瓶中”開(kāi)始制備供試品溶液，分別在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值為1.64%，表明所建立的花椒總酰胺定量檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將一份標(biāo)記好的花椒提取物供試品溶液，用錫箔紙包裹嚴(yán)密，置于冰箱中，避光保存，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h的時(shí)候取出放至室溫，在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD值為1.36%，表明所建立的花椒總酰胺定量檢測(cè)方法的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取9份花椒酰胺提取物，每份5 mg，分為三組。每組分別精密加相當(dāng)于花椒酰胺提取物中羥基-α-山椒素成分量的80%、100%、120%，按“2.2.2”項(xiàng)下“稱定重量”開(kāi)始制備供試品溶液，分別在270 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算平均回收率為100.25%，RSD值為2.16%，表明所建立的花椒總酰胺定量檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.9 花椒總酰胺提取率計(jì)算

2.3 花椒酰胺提取物中羥基-α-山椒素含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性[11～12]采用Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，流動(dòng)相甲醇∶水(0.1%磷酸)=70∶30，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 同“2.2.1”對(duì)照品溶液的制備。

2.3.3 供試品溶液的制備 同“2.2.2”供試品溶液的制備。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.4”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液。采用高效液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以羥基-α-山椒素峰面積為Y值，以不同羥基-α-山椒素濃度為X值，采用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為Y = 420 319X - 752.81(r = 0. 9992)，表明羥基-α-山椒素濃度在8～20 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度考察 將同一羥基-α-山椒素對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值0.72%，表明儀器的精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性考察 取“2.2.6”項(xiàng)下的6份重復(fù)性樣品進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD值1.35%，表明所建立的花椒羥基-α-山椒素定量檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 將同一供試品，分別在0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣，測(cè)定羥基-α-山椒素峰面積，計(jì)算RSD值1.57%，表明所建立的花椒羥基-α-山椒素定量檢測(cè)方法的穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取“2.2.8”項(xiàng)下的9份加樣回收率樣品液進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率為103.71%，RSD值為2.42%，表明所建立的花椒羥基-α-山椒素定量檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 花椒羥基-α-山椒素提取率計(jì)算

2.4 單因素試驗(yàn)考察

花椒提取過(guò)程的影響因素包括粉碎粒徑，提取溶劑濃度和用量，浸提溫度和時(shí)間以及攪拌速度6個(gè)因素，每個(gè)因素取常用5個(gè)參數(shù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。因單因素試驗(yàn)次數(shù)較多，且總酰胺是重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，故單因素以花椒總酰胺含量為指標(biāo)進(jìn)行考察。

2.4.1 粉碎粒徑考察 根據(jù)藥典篩得到花椒粉碎粒度分別為24目、50目、65目、80目和100目，每種粒徑花椒粉末稱取10g，置棕色具塞錐形瓶中，加10倍量100%甲醇，以60 rpm的轉(zhuǎn)速在50℃浸提4 h，按“2.2.2”項(xiàng)下“過(guò)濾”開(kāi)始制備供試品溶液，計(jì)算花椒總酰胺提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4-A，用二號(hào)篩(24目)過(guò)篩時(shí)花椒粉和內(nèi)部果殼纖維不能有效分離，花椒過(guò)篩的目數(shù)越大(粉碎粒徑越小)，總酰胺含量越高。但是粒徑太小時(shí)，因?yàn)榛ń犯缓椭渍尺B導(dǎo)致過(guò)篩較困難，當(dāng)粒度為65 目時(shí)，提取率最大。當(dāng)粒度超過(guò)80 目，提取率出現(xiàn)下降，可能因?yàn)榉勰┨?xì)，煎煮過(guò)程中凝結(jié)成團(tuán)，不利于團(tuán)塊內(nèi)部的酰胺溶出，故選擇65目粉碎粒徑繼續(xù)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，選擇50～80目作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)粉碎粒徑范圍。

2.4.2 提取溶劑考察 精密稱取10g花椒粉末(65目)5份，分別置棕色具塞錐形瓶中，加10倍量100%甲醇、80%甲醇、60%甲醇、40%甲醇、20%甲醇，以60 rpm的轉(zhuǎn)速在50℃浸提4 h，按“2.2.2”項(xiàng)下“過(guò)濾”開(kāi)始制備供試品溶液，計(jì)算花椒總酰胺提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4-B，80%甲醇的提取率最高，故選80%甲醇作為最佳濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇60%～100%濃度甲醇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提取溶劑濃度范圍。

2.4.3 溶劑量考察 精密稱取10 g花椒粉末(65目)5份，分別置棕色具塞錐形瓶中，分別加5倍、10倍、15倍、20倍和25倍80%甲醇，以60 rpm的轉(zhuǎn)速在50℃浸提4h，按“2.2.2”項(xiàng)下“過(guò)濾”開(kāi)始制備供試品溶液，計(jì)算花椒總酰胺提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4-C，料液比1∶15即達(dá)到提取飽和，隨著溶劑用量增多，提取率增加不明顯反而有一定的減少，有可能是過(guò)多的溶劑回收會(huì)造成酰胺更多的損失，從節(jié)約能源和減少后期回收溶劑等方面考慮，故選15作為最佳倍量繼續(xù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇10～20倍作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)料液比范圍。

2.4.4 浸泡溫度 精密稱取10g花椒粉末(65目)5份，分別置棕色具塞錐形瓶中，分別加15倍80%甲醇，分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，以60 rpm的轉(zhuǎn)速浸提4h，按“2.2.2”項(xiàng)下“過(guò)濾”開(kāi)始制備供試品溶液，計(jì)算花椒總酰胺提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4-D，浸提溫度在40℃達(dá)到最大值，隨著溫度升高，提取率增加不明顯反而有一定的減少，有可能是高溫加劇酰胺的氧化損失，故選40℃作為最佳浸泡溫度繼續(xù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇30～50℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)浸泡溫度范圍。

2.4.5 浸泡時(shí)間 精密稱取10 g花椒粉末(65目)5份，分別置棕色具塞錐形瓶中加15倍80%甲醇，在40℃以60 rpm的轉(zhuǎn)速浸提2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，按“2.2.2”項(xiàng)下“過(guò)濾”開(kāi)始制備供試品溶液，計(jì)算花椒總酰胺提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4-E，浸泡時(shí)間越長(zhǎng)提取率越高，4 h后基本飽和，故選4 h作為最佳浸泡時(shí)間繼續(xù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇3～5 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)浸泡時(shí)間范圍。

2.4.6 攪拌速度 精密稱取10 g花椒粉末(65目)5份，分別置棕色具塞錐形瓶中加15倍80%甲醇，浸提溫度40℃，分別以20 rpm、30 rpm、40 rpm、50 rpm、60 rpm、的轉(zhuǎn)速浸提4 h，按“2.2.2”項(xiàng)下“過(guò)濾”開(kāi)始制備供試品溶液，計(jì)算花椒總酰胺提取率。結(jié)果見(jiàn)圖4-F，浸提轉(zhuǎn)速越高提取率越高，50 rpm達(dá)到最大提取率后趨于平和。所以選擇50 rpm作為浸提轉(zhuǎn)速繼續(xù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，選擇40～60 rpm作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)浸提轉(zhuǎn)速范圍。

2.5 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上運(yùn)用Design-Expert軟件的Plackett-Burman模塊，對(duì)每個(gè)因素選取2 個(gè)水平(-1、1)，考察各因素水平對(duì)花椒提取物得率、總酰胺提取率和羥基-α-山椒素提取率的影響。采用總評(píng)歸一值法[overall desirabilityvalue，OD 值，利用Hassan 法對(duì)各效應(yīng)值進(jìn)行歸一化，本次實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)值高越好，因此，歸一值di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，再對(duì)歸一值求幾何平均值，OD=(d1，d2，…，dn)1/n]的影響[13]。實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)因素和結(jié)果進(jìn)行方差分析，對(duì)模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢查，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 PB實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 PB實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

由表3 可以看出，所建立的模型具有顯著性(P<0. 01)，表明該模型可用于花椒酰胺提取因素的顯著性分析。其中花椒粉碎粒徑(P<0.05)、浸提時(shí)間(P<0.01)和溶劑用量(P<0.05)三個(gè)因素具有顯著性，但是粉碎粒徑由過(guò)篩目數(shù)決定，是一個(gè)非連續(xù)變量，故將此浸提時(shí)間和溶劑用量2個(gè)因素作為下一步響應(yīng)面法優(yōu)化的因素。甲醇濃度、浸提溫度和攪拌速度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，因此結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果固定花椒粉碎粒徑65目(四號(hào)篩)，80%甲醇浸提4 h，攪拌速度50 rpm四個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.6 Central-Composite Design效應(yīng)面法優(yōu)選

在單因素試驗(yàn)和PB實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定花椒粉碎粒徑65目(四號(hào)篩)，甲醇濃度80%，浸提時(shí)間4h，攪拌速度50rpm，以溶劑倍量和浸提溫度為因變量，以O(shè)D值為自變量，根據(jù)Design Expert軟件的Central-Composite Design中心組合試驗(yàn)?zāi)K進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見(jiàn)表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 因素水平

表5 Central-Composite Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與效應(yīng)值

運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以花椒提取總評(píng)值OD值為響應(yīng)值，對(duì)溶劑用量、浸提溫度進(jìn)行多元線性回歸二項(xiàng)式方程擬合，擬合的方程模型為OD=0.88+0.19A-0.24B-0.11AB-0.2A2-0.23B2(R2=0.8217；RAdj2=0.6943)，對(duì)模型采用F檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢查，結(jié)果見(jiàn)表6。二項(xiàng)式模型P<0.05，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好。以O(shè)D值最大值為目標(biāo)，根據(jù)“Design Expert”軟件預(yù)算得最佳花椒提取工藝參數(shù)為：溶劑倍量19倍，浸提溫度32℃，此情況下OD值預(yù)測(cè)最大值1.0089。OD值提取率與溶劑倍量和浸提溫度的三維效應(yīng)面曲線見(jiàn)圖5。

表6 Central-Composite Design實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.7 提取工藝參數(shù)驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)際條件的可操作性，將工藝條件優(yōu)化為：花椒粉碎粒徑65目(四號(hào)篩)，甲醇濃度80%，溶劑倍量19倍，浸提溫度32℃，攪拌速度50rpm，浸提時(shí)間4h，結(jié)果見(jiàn)表7。

花椒提取物得率為17.91%，總酰胺提取率為6.32%，羥基-α-山椒素提取率為4.99%，平均OD值為1.0161>1.0089。由結(jié)果可知，通過(guò)PB-CCD實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得花椒提取工藝模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際提取值結(jié)果接近，表明建立的花椒提取工藝模型預(yù)測(cè)性良好。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

花椒作為典型的藥食同源物質(zhì)，作為食物是因?yàn)槠涮赜械穆槲讹L(fēng)味，作為中藥溫里藥是因?yàn)槠湫孕翜?，都與其所含酰胺類成分有關(guān)。日本學(xué)者以人體的刺麻感受作為指標(biāo)的研究結(jié)果表明花椒中以羥基-α-山椒素為主的酰胺類成分是其產(chǎn)生麻感的主要成分[14～15]。但是由于花椒酰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有大量的共軛三烯鍵，在室溫的條件下就極易被氧化，其氧化物的麻度降低[16]。本項(xiàng)目制備的花椒總酰胺提取物其穩(wěn)定性要高于高純度的花椒酰胺，且提取方式都有利于工業(yè)化生產(chǎn)。研究結(jié)果為花椒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了一定的借鑒，也為花椒產(chǎn)業(yè)深加工所面臨的問(wèn)題進(jìn)行了一定的探索。