楊 森，李攀登，李靈娟，王 彬，楊振豪

(河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南 鄭州 451162)

當(dāng)前禽類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)正朝著規(guī)模型、集約型趨向快速發(fā)展，致使疾病尤其是病毒性疾病群發(fā)風(fēng)險(xiǎn)被放大，科學(xué)養(yǎng)殖和疾病診施重要性不言自明。當(dāng)今國(guó)家大力推動(dòng)"減抗、替抗、無(wú)抗"的大環(huán)境下[1]，中藥以特有的多靶點(diǎn)、廣譜抗菌作用、無(wú)藥殘綠色安全等優(yōu)勢(shì)，在病毒病防療中優(yōu)勢(shì)日益凸顯。

同時(shí)，中藥制劑也以其化合物種類(lèi)復(fù)雜、成分未可盡知的特點(diǎn)，常在藥典或質(zhì)量規(guī)范中面臨操作繁雜而導(dǎo)致有效部位轉(zhuǎn)移率低、定量定性存在干擾等窘境。甚至相當(dāng)數(shù)量中藥制劑無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，導(dǎo)致不同生產(chǎn)廠(chǎng)家經(jīng)現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)判為合格的樣品，有效成分含量差異較大的情況，影響了產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。故探索穩(wěn)定及可靠的質(zhì)控方法也是中獸藥發(fā)展進(jìn)程的難點(diǎn)課題之一。

清瘟解毒口服液是一種以禽類(lèi)為靶動(dòng)物的中獸藥復(fù)方制劑，主治雞外感發(fā)熱[2]。該制劑含6種藥味：梔子250g、黃芩225g、連翹200g、板藍(lán)根200g、地黃150g、玄參150g?！东F藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)該方黃芩苷、連翹對(duì)照藥材和梔子苷規(guī)范了鑒別要求，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。目前有文獻(xiàn)刊登了該制劑中的黃芩苷[3]、連翹苷的定量分析方法，但對(duì)于方中用量最大的梔子未見(jiàn)科學(xué)系統(tǒng)的定量方法研究文獻(xiàn)。該試驗(yàn)擬對(duì)淸瘟解毒口服液中梔子苷含量進(jìn)行分析方法確定，并在方法學(xué)上進(jìn)行適當(dāng)評(píng)價(jià)，致力對(duì)本制劑的質(zhì)量控制貢獻(xiàn)思路。

1 儀器材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AT(UVD)高效液相色譜儀；Sartorius SQP型電子分析天平；Thermo Genesys 10s型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；超聲波清洗儀(江蘇昆山)；津騰真空抽濾泵(0.45 μm濾膜)；和泰純水儀。

1.2 試藥與試劑

梔子苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110749-201718，含量97.6%)，色譜級(jí)甲醇、乙腈(天津四友)，其它試劑為分析純。

清瘟解毒口服液，由河南牧翔動(dòng)物藥業(yè)有限公司(以下簡(jiǎn)稱(chēng)牧翔藥業(yè))生產(chǎn)；陰性對(duì)照樣品由牧翔藥業(yè)根據(jù)國(guó)家獸藥典處方中藥味及投料量，生產(chǎn)出的缺梔子陰性樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件的選擇

2.1.1 紫外可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)選取 依實(shí)驗(yàn)室處理經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于糖苷類(lèi)化合物多用甲醇-水系統(tǒng)作提取溶媒[4]，此處以50%甲醇溶解適量梔子苷對(duì)照品，供190～800 nm下紫外-可見(jiàn)光吸收度波譜掃描用，運(yùn)行結(jié)果如圖1。預(yù)測(cè)梔子苷濃度將在優(yōu)勢(shì)波峰238 nm處呈現(xiàn)良好紫外吸收度線(xiàn)性相關(guān)，選擇此寬度作梔子苷HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。

2.1.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5?m)；流動(dòng)相：乙腈-水(11∶89)；波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：30℃；流速：1.0ml·min-1；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 對(duì)照品溶劑的選擇及制備

精密稱(chēng)取梔子苷對(duì)照品26.75mg (含量97.6%)置100ml量瓶中，以50%甲醇溶解，定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5 mL分別以純甲醇、50%甲醇溶解至兩組25 mL量瓶中，定容，搖勻，即得梔子苷含量為52.22 μg·mL-1的不同溶媒工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，計(jì)算譜圖指標(biāo)。其中50%甲醇溶解的對(duì)照品溶液對(duì)應(yīng)譜圖的色譜峰型、柱效均優(yōu)于純甲醇配制的對(duì)照品溶液對(duì)應(yīng)譜圖指標(biāo)。故選定50%甲醇作為配置對(duì)照品溶劑，結(jié)果如圖2。

2.3 供試品提取溶劑的選擇及制備

精密量取本品各1ml，分別置三組100 mL量瓶中，各以50%甲醇、70%甲醇、純甲醇適量溶解，超聲提取20 min后，冷卻至室溫，定容，搖勻，即得不同溶媒制備的供試品溶液。

過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，計(jì)算譜圖指標(biāo)。結(jié)果如表1：

表1 不同提取溶劑的供試品色譜指標(biāo)

其中，50%甲醇提取的供試品溶液對(duì)應(yīng)譜圖雖柱效較高，但是分離度、峰形、以及定量表現(xiàn)均遜于以70%甲醇所制備者(如圖3)。故選70%甲醇作供試品提取溶劑。

2.4 空白溶液制備和專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密量取陰性對(duì)照樣品1 ml，置100 ml量瓶中，以適量的70%甲醇溶解，超聲提取20 min后，冷卻至室溫，定容，搖勻，即得空白樣品溶液。

過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，采集色譜圖(如圖4)?？梢?jiàn)在本方法色譜條件下，清瘟解毒口服液中梔子苷目標(biāo)峰無(wú)干擾。

2.5 線(xiàn)性范圍考察

精密量取梔子苷儲(chǔ)備液各1 mL、2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、15 mL分別置不同25 mL量瓶中，以50%甲醇定容，搖勻，過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，計(jì)算目標(biāo)峰面積積分結(jié)果。以峰面積值A(chǔ)為因變量，濃度值C為自變量進(jìn)行線(xiàn)性回歸解析，得：A = 3×107×C-3370.3，(R=1.0000)。表明梔子苷在進(jìn)樣濃度為10.44～156.65μg·mL-1內(nèi)時(shí)，與對(duì)應(yīng)峰面積值所擬合的回歸方程線(xiàn)性相關(guān)度高。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 儀器精密度試驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀(n=6)，同樣以2.1.2項(xiàng)的色譜條件洗脫，計(jì)算目標(biāo)峰面積積分結(jié)果。得結(jié)果間RSD=0.19%，故所用儀器精密度高。

2.6.2 方法重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品，按照2.3項(xiàng)下所確定的處理方法制備供試品溶液(n=6)，過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，以2.1.2項(xiàng)的色譜條件洗脫，并計(jì)算目標(biāo)峰面積積分結(jié)果。以外標(biāo)法計(jì)得梔子苷含量分別為：8.38、8.19、8.24、8.23、8.22、8.25 mg·mL-1，RSD=0.79%。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取2.6.2重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下所取的樣品1 mL，在2.3項(xiàng)下"置100 mL量瓶中"前精密加入梔子苷儲(chǔ)備液5ml，其后處理步驟與2.3項(xiàng)下所確定的處理方法一致，過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，以2.1.2項(xiàng)的色譜條件洗脫，并計(jì)算目標(biāo)峰面積積分結(jié)果、測(cè)得值及回收率。結(jié)果如表2：

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定

測(cè)量樣品取用了牧翔藥業(yè)生產(chǎn)的六批清瘟解毒口服液樣品，各按2.3項(xiàng)下所選定的樣品制備方法制取供試品溶液，過(guò)微孔濾膜，注于液相色譜儀，以2.1.2項(xiàng)的色譜條件洗脫，計(jì)算梔子苷含量，結(jié)果如表3：

由以上六批生產(chǎn)樣品檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，牧翔藥業(yè)所生產(chǎn)的清瘟解毒口服液樣品含量精密度良好，批次間質(zhì)量穩(wěn)定，工藝可靠。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

清瘟解毒口服液方中含多味中藥，制劑企業(yè)在制備過(guò)程中為保持其性狀及藥學(xué)穩(wěn)定性也不可避免加入特定輔料，成分復(fù)雜。通過(guò)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中測(cè)定梔子藥材及飲片所含梔子苷的方法流動(dòng)相乙腈-水(15∶85)時(shí)[5]，目標(biāo)峰過(guò)早地與雜質(zhì)同被洗出、分離不佳，峰形對(duì)稱(chēng)性稍差，以致不能滿(mǎn)足對(duì)于以藥典標(biāo)準(zhǔn)所生產(chǎn)的該口服液樣品的成藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的定量性能需求。通過(guò)色譜條件調(diào)整，使其中雜峰更早地集中流出，縮短了實(shí)際分析周期，峰形優(yōu)異，分離度良好，可以達(dá)到質(zhì)控的要求。

考察了常用提取溶劑的分析效果，并通過(guò)液相色譜方法進(jìn)行結(jié)果評(píng)估。最終通過(guò)條件篩選確定了70%甲醇超聲提取的前處理方法，簡(jiǎn)便有效的同時(shí)兼?zhèn)鋬?yōu)異定量性能。

綜上，本試驗(yàn)所確定含量測(cè)定方法能滿(mǎn)足中獸藥制劑清瘟解毒口服液中梔子苷的定量分析要求，為生產(chǎn)該制劑的企業(yè)質(zhì)量控制提供了規(guī)范、為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)化擴(kuò)展貢獻(xiàn)參考依據(jù)。